重慶FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

蛋白酶用于生成肽，用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)。這些應(yīng)用包括蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥的深度表征。由于遺漏了切割和樣品制備誘導(dǎo)的偽影，傳統(tǒng)的蛋白酶并不總是理想的，因此需要具有不同特異性的蛋白酶工具箱。Genovis的GingisREX 是一種精氨酸特異性蛋白酶，可將蛋白質(zhì) C 末端消化為精氨酸殘基。與胰蛋白酶肽相比，所得肽更長(zhǎng)，并可能導(dǎo)致序列覆蓋率增加。質(zhì)譜分析中蛋白酶的特異性對(duì)于獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集和避免復(fù)雜的數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要。作為模型底物，使用胰島素氧化β鏈來(lái)比較 GingisREX 和 ArgC 的酶特異性。胰島素氧化β鏈含有一個(gè)精氨酸和一個(gè)賴氨酸殘基。在RP-HPLC和質(zhì)譜法上分析GingisREX和ArgC的酶切肽。GingisREX在賴氨酸殘基上沒(méi)有酶活性或其他額外活性，即使在長(zhǎng)時(shí)間孵育過(guò)夜后，酶與底物的比例也很高（1：5）。然而，ArgC在精氨酸殘基上顯示出主要活性，但在賴氨酸殘基上也可以看到酶消化。在酶與底物的比例為 1：20 和過(guò)夜孵育下，證明了 ArgC 的額外非特異性活性。在相同條件下，GingisREX未檢測(cè)到這種情況。數(shù)據(jù)證實(shí)了GingisREX精氨酸殘基的特異性活性，并顯示使用Arg-C在賴氨酸和其他殘基處的非特異性消化。剩下一個(gè)連接子殘基（甘氨酸殘基），這有助于識(shí)別位于Fc區(qū)域的修飾。重慶FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

不同于IdeS，Genovis的FabDELLO 是一種蛋白酶，可在鉸鏈上方的單個(gè)位點(diǎn)消化人 IgG1，在兩小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生完整的 Fab 和 Fc 片段，無(wú)需還原條件。該酶對(duì)具有突變鉸鏈區(qū)域的抗體（如 LALA 突變）具有活性，并啟用中級(jí) LC-MS 來(lái)表征具有突變鉸鏈的抗體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。FabDELLO 在鉸鏈上方的單個(gè)位點(diǎn)消化人 IgG1 （...KSCDK / THTCPPCP...），生成完整的 Fab 和 Fc 片段。FabDELLO 是一種賴氨酸特異性蛋白酶。單個(gè)消化位點(diǎn)是人 IgG1 的三維結(jié)構(gòu)的結(jié)果，使這種賴氨酸暴露于酶中。如果去除N-聚糖，則Fc上暴露的賴氨酸處可能會(huì)出現(xiàn)額外的消化位點(diǎn)。FabDELLO在天然條件下具有活性，需要鈣離子的存在。在37°C和pH 7-8.5下獲得良好活性。FabDELLO 是從 Bdellovibrio 細(xì)菌克隆而來(lái)的，并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有 His 標(biāo)簽，分子量為 32 kDa。江蘇GingisREXIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶Genovis的FabRICATOR （IdeS蛋白酶）在30分鐘內(nèi)消化IgG，如果孵育時(shí)間延長(zhǎng)，則不存在過(guò)度消化的風(fēng)險(xiǎn)。

Blinatumomab（一種對(duì) CD19 和 T 細(xì)胞標(biāo)志物 CD3 具有特異性的 BiTE 分子）的研究級(jí)生物仿制藥在室溫下用固定化過(guò)夜的 Genovis的GlySERIAS 消化。通過(guò)LC-MS對(duì)消解樣品的直接分析表明，所有三個(gè)連接子區(qū)域均被消解，α-CD3 VL和VH鏈洗脫為一個(gè)色譜峰，α-CD19 VH和VL鏈作為單獨(dú)的峰洗脫。來(lái)自連接的 α-CD3 VH 和 α-CD19 VH 結(jié)構(gòu)域的小峰顯示該短連接子未完全消化，表明 GlySERIAS 對(duì)短連接子的活性較低。與完整的蛋白質(zhì)分析相比，四個(gè)結(jié)構(gòu)域的分離提供了具有單同位素分辨率的高質(zhì)量光譜?？梢杂^察到每個(gè)結(jié)構(gòu)域的幾個(gè)不同變體，剩余的連接子殘基數(shù)量不同。在色譜分離過(guò)程中，α-CD3 VH結(jié)構(gòu)域無(wú)法從α-CD19 VH結(jié)構(gòu)域完全基線分離，導(dǎo)致在相關(guān)質(zhì)譜中觀察到一些共洗脫。四個(gè)結(jié)構(gòu)域的分離產(chǎn)生了有關(guān)在完整蛋白質(zhì)水平上鑒定的蛋白質(zhì)修飾位置的信息。例如，在完整水平上鑒定的 37 Da 的蛋白質(zhì)修飾被分配給 α-CD3 VH 鏈。此外，240Da 和 320da 的兩個(gè)修飾分別被分配給 α-CD3 VL 結(jié)構(gòu)域。后者還含有一個(gè)帶有五六個(gè)組氨酸殘基的 His 標(biāo)簽。這些數(shù)據(jù)證明了使用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 對(duì)包含多個(gè)柔性連接子蛋白進(jìn)行質(zhì)量控制的中級(jí)工作流程的強(qiáng)大功能。

與肽圖譜相比，根據(jù)Genovis科學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)，尤其是對(duì)于像抗體這樣的分子，許多人在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中做了太多的肽圖譜，而中級(jí)水平（Middle-level）的方法可以很好地工作。中級(jí)方法（IdeS酶切抗體）需要更少的實(shí)際操作步驟和較少的示例處理，所有這些都意味著過(guò)程中出錯(cuò)的事情更少。我們的許多酶可以作為平臺(tái)方法，同樣的方法適用于絕大多數(shù)的抗體，這不是肽圖的情況下，可能需要優(yōu)化整個(gè)樣品制備，LC分離，質(zhì)譜設(shè)置和數(shù)據(jù)分析的每個(gè)不同的抗體分析。這些變化可能是很小的，但沒(méi)有一種適用于所有肽圖的方法。由于分析和數(shù)據(jù)分析的簡(jiǎn)單性，中級(jí)方法非常適合自動(dòng)化和高通量的工作流程。肽圖當(dāng)然可以自動(dòng)用于樣品制備，但高通量肽圖生成大量數(shù)據(jù)，仍然需要徹底分析。事實(shí)上，肽圖譜是一個(gè)多步驟的過(guò)程，每一個(gè)步驟都可能破壞方法，并可能導(dǎo)致破壞蛋白質(zhì)的人工制品，很難交叉訓(xùn)練給非專業(yè)人員。中級(jí)水平的方法很容易交叉訓(xùn)練，我們的方法在質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室中被成功地使用。肽圖譜是一種用于修飾分析和氨基酸確認(rèn)的方法，但一旦完成了這一工作，我相信使用中級(jí)分析可以成功地更有效地完成抗體樣本的大部分工作。在鉸鏈正上方的一個(gè)特定位點(diǎn)消化人 IgG1，產(chǎn)生完整的 Fab 和 Fc 片段。

上海倍篤生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱“倍篤生物”），由中國(guó)科學(xué)院及生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界人士，于2018年1月共同創(chuàng)立。公司代理多個(gè)品牌的儀器、試劑及耗材（如Genovis的IdeS酶），遵守相關(guān)法規(guī)要求，如cGMP規(guī)范、ISO13485質(zhì)量管理體系認(rèn)證等，致力于為診斷領(lǐng)域如分子診斷及病原微生物檢測(cè)研發(fā)等，藥物研發(fā)領(lǐng)域如細(xì)胞基因藥物、核酸藥物、抗體藥物、干細(xì)胞及外泌體研究等客戶提供合規(guī)、高質(zhì)量物料及專業(yè)服務(wù)，以期與客戶共同協(xié)作，加快研發(fā)及生產(chǎn)進(jìn)度，為客戶提供更多價(jià)值。孵育時(shí)間為過(guò)夜（16-18小時(shí)），并且由于酶的特異性，沒(méi)有過(guò)度消化的風(fēng)險(xiǎn)。浙江FabRICATOR ZIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

FabRICATOR（IdeS蛋白酶） 的高特異性也意味著相同的消化方案可以作為平臺(tái)方法應(yīng)用于許多不同的抗體。重慶FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

Genovis的FabRICATOR MagIC自動(dòng)樣品制備可用于分析和監(jiān)測(cè)不同的CQA。mAb在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過(guò)程中的氧化就是這樣一種CQA，可能會(huì)影響zhiliao產(chǎn)品的質(zhì)量。為了展示FabRICATOR MagIC如何解決這個(gè)問(wèn)題，對(duì)6種mAb的混合物進(jìn)行強(qiáng)制降解（室溫下3個(gè)月），并通過(guò)反相LC-MS進(jìn)行分析。當(dāng)在完整水平上分析mAb時(shí)，可以檢測(cè)到mAb5豐度的顯著差異，同時(shí)出現(xiàn)許多新的峰。然而，無(wú)法獲得可靠的質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用FabRICATOR MagIC，mAb5變化的來(lái)源在Fab區(qū)域內(nèi)。隨后還原為 Fc/2、LC 和 Fd' 片段，可以識(shí)別差異是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化，通過(guò)形成氧代內(nèi)酯 （+14 Da） 和二氧代內(nèi)酯 （+30 Da） 以及 mAb5 LC （-18 Da） 的琥珀酰亞胺化來(lái)揭示。此外，還可檢測(cè)到mAb3輕鏈的異構(gòu)化。該示例說(shuō)明了FabRICATOR MagIC在mAb中級(jí)分析中的強(qiáng)大功能，它創(chuàng)建的片段足夠小，可以精確定位特定的修飾，而無(wú)需耗時(shí)耗費(fèi)資源的肽圖分析，所有這些都以相對(duì)較少的手動(dòng)操作時(shí)間快速完成。重慶FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶