RIP-Seq/qPCR檢測(cè)驗(yàn)證

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2024-08-29

RIP-Seq是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作組的高通量技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作蛋白/RNA，進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白/RNA互作組數(shù)據(jù)檢測(cè)，或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異研究。因此，該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。

RIP-qPCR是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作的靶向驗(yàn)證技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的蛋白/RNA互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，明確蛋白/RNA的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白/RNA互作檢測(cè)驗(yàn)證，或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作差異研究。因此，該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。

RIP-Seq檢測(cè)和RIP-qPCR驗(yàn)證技術(shù)價(jià)值：

（1）蛋白與RNA相互作用數(shù)據(jù)，是探究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究的重要內(nèi)容，體現(xiàn)機(jī)制研究的深度，能明顯提升臨床基礎(chǔ)類研究文章的檔次。

（2）蛋白與RNA互作組檢測(cè)，常用于RBP蛋白的結(jié)合譜研究，如m6A-RIP-Seq。但理論上蛋白和RNA生物大分子，均有結(jié)合調(diào)控的可能。因此可用于目的蛋白結(jié)合RNA調(diào)控方向的機(jī)制探究，可用于是經(jīng)典老基因的機(jī)制突破。

（3）蛋白與RNA互作，其結(jié)合RNA的區(qū)域，是進(jìn)一步研究互作機(jī)制和功能的關(guān)鍵內(nèi)容，能夠明顯提高機(jī)制研究的高度。

RIP-Seq檢測(cè)和RIP-qPCR驗(yàn)證要點(diǎn)：

（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：盡量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組別設(shè)計(jì)和生物學(xué)重復(fù)檢測(cè)，提高后續(xù)驗(yàn)證的陽(yáng)性率。常規(guī)過(guò)表達(dá)單組（Ab IP vs IgG IP）；動(dòng)態(tài)互作組學(xué)（實(shí)驗(yàn)組vs對(duì)照組vs IgG組）。根據(jù)目的設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)重復(fù)。如果后續(xù)以RIP-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行互作組標(biāo)準(zhǔn)分析，則需要3-4組生物學(xué)重復(fù)；如果后續(xù)以尋找關(guān)鍵互作RNA，進(jìn)行深入的機(jī)制研究，則建議1-2次生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)驗(yàn)顯示單次重復(fù)假陽(yáng)性率達(dá)90%。RIP-Seq強(qiáng)烈建議設(shè)置實(shí)驗(yàn)組別和生物學(xué)重復(fù)檢測(cè)。

（2）蛋白表達(dá)和細(xì)胞量：細(xì)胞用量要不少于5e7（金標(biāo)準(zhǔn)：320g離心細(xì)胞量50μl，保障項(xiàng)目用量）。本底低表達(dá)蛋白，建議使用過(guò)表達(dá)組進(jìn)行檢測(cè)。蛋白表達(dá)可根據(jù)WB結(jié)果或初步根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)判定（Proteomics DB，Human Protein Atlas）。

（3）抗體關(guān)鍵質(zhì)控：抗體特異性與親和效價(jià)要求高，盡量采用標(biāo)簽抗體或經(jīng)過(guò)CoIP效果驗(yàn)證的抗體?？贵w質(zhì)量參差不齊（WB能檢測(cè)到預(yù)期條帶不到1/2，能檢測(cè)到良好結(jié)果的不到1/4）和存在非特異性結(jié)合（幾乎所有的抗體都存在非特異結(jié)合，部分非特異結(jié)合條帶遠(yuǎn)大于目的條帶），RIP-Seq需做WB和IP-WB質(zhì)控?？贵w可參考數(shù)據(jù)庫(kù)（Validated Antibody DB)。

（4）IP送樣建議：由于RIP的產(chǎn)物量極少，需要微量建庫(kù)，強(qiáng)烈建議整包交給公司進(jìn)行RIP-Seq檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

（5）互作蛋白篩選和驗(yàn)證：數(shù)據(jù)分析以信號(hào)強(qiáng)度作為強(qiáng)陽(yáng)篩選，以文獻(xiàn)查閱，功能匹配，批量RIP-qPCR驗(yàn)證，提高驗(yàn)證成功率。

RIP-Seq檢測(cè)和RIP-qPCR驗(yàn)證優(yōu)劣勢(shì)：

優(yōu)勢(shì)：高通量獲得目的蛋白的專屬RNA互作庫(kù)，獲得目的蛋白的互作RNA機(jī)制分子。

劣勢(shì)：RIP-Seq的RNA庫(kù)魚(yú)龍混雜，包含目的蛋白的直接/間接的互作RNA，非特異結(jié)合，殘留RNA。RIP-Seq技術(shù)和分析門(mén)檻高；RIP-qPCR驗(yàn)證成功率低，導(dǎo)致研發(fā)進(jìn)展反復(fù)跌宕、時(shí)間和經(jīng)費(fèi)成本占用較大，嚴(yán)重影響士氣。該項(xiàng)目的成功實(shí)施，比較依賴成熟和有分析經(jīng)驗(yàn)的團(tuán)隊(duì)，強(qiáng)烈建議整包交給專業(yè)的服務(wù)商開(kāi)展檢測(cè)。

RIP-Seq互作組驗(yàn)證，即在互作組分析篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用RIP-qPCR技術(shù)對(duì)感興趣分子進(jìn)行靶向檢測(cè)，更加精細(xì)，也是互作組驗(yàn)證的必由之路。成功驗(yàn)證上岸的基礎(chǔ)是理想的互作組數(shù)據(jù)庫(kù)和豐富的分析經(jīng)驗(yàn)，方能事半功倍。廣州基云生物，在IP互作組檢測(cè)和關(guān)鍵機(jī)制分子篩選驗(yàn)證領(lǐng)域，具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，助力您的互作機(jī)制研究。