廣西胰酶常見(jiàn)問(wèn)題

    (不含EDTA含酚紅)性質(zhì)、用途與生產(chǎn)工藝背景胰酶又名胰醇素、胰液素。白色或淡黃色無(wú)定形粉末。系從各種動(dòng)物胰臟制取的混合物，主要是蛋白酶、脂酶、淀粉酶。溶于水呈微渾溶液。不溶于醇、醚。有引濕性，遇酸、堿及熱即喪失活力，水溶液遇酸、熱、重金屬或單寧酸時(shí)產(chǎn)生沉淀。為助消化藥，用于缺乏胰液的***癥。也用于皮革工業(yè)和紡織印染，主要用于酶法脫毛。將絞碎的豬胰漿經(jīng)***、提取、沉淀、脫脂、干燥、粉碎而得。簡(jiǎn)介(不含EDTA含酚紅)為細(xì)胞培養(yǎng)基，1.不含EDTA含酚紅：含酚紅，（1：250）溶于HBSS溶液，不含鈣鎂。-20℃保存。胰(不含EDTA含酚紅)含，不含EDTA和酚紅，溶于無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中，經(jīng)過(guò)濾除菌，可以直接用于培養(yǎng)細(xì)胞和組織的消化，通常室溫消化2分鐘左右就消化下大多數(shù)貼壁細(xì)胞。使用方法(不含EDTA含酚紅)使用說(shuō)明---貼壁細(xì)胞Chemicalbook的消化：a)吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。b)加入少量胰蛋白酶消化液，蓋過(guò)細(xì)胞即可，室溫放置1-2分鐘。不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同，對(duì)于貼壁牢固的細(xì)胞可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。c)顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化。 胰酶是一種復(fù)合消化酶制劑。廣西胰酶常見(jiàn)問(wèn)題

胰蛋白酶(Trypsin)是由胰臟產(chǎn)生沒(méi)有活性的胰蛋白酶原分泌到小腸后，小腸內(nèi)的腸肽酶會(huì)活化該酶原，形成胰蛋白酶。胰蛋白酶的特點(diǎn)在于已經(jīng)活化的胰蛋白酶，能夠繼續(xù)活化更多胰蛋白酶原，這種過(guò)程即自動(dòng)催化。胰蛋白酶在小腸工作，它會(huì)將蛋白質(zhì)水解為肽進(jìn)而分解為氨基酸，其**適溫度約為 37°℃。Trypsin solution(2.5%)由 2.5%胰酶組成，不含 EDTA，經(jīng)過(guò)濾除菌。本試劑可以直接用于培養(yǎng)細(xì)胞的消化，或者一些組織的消化，通常室溫下 1min 左右就可以消化下大多數(shù)貼壁細(xì)胞。該溶液濃度較高，可以稀釋到相應(yīng)濃度后使用。浙江國(guó)產(chǎn)胰酶進(jìn)口實(shí)際消化后細(xì)胞狀態(tài)不會(huì)有太大差異，注意控制消化時(shí)間即可。

    胰酶使用注意：1、在使用胰酶細(xì)胞消化液的過(guò)程中要特別注意避免消化液被**污染。2、胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則細(xì)胞鋪板后生長(zhǎng)狀況會(huì)較差。貼壁細(xì)胞的消化：1、吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清2、加入少量胰酶細(xì)胞消化液，略蓋過(guò)細(xì)胞即可，根據(jù)胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘（不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同）3、顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀；或者用***吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來(lái)。4、此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來(lái)。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細(xì)胞，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。常用的細(xì)胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞外基質(zhì)）水解，改變細(xì)胞間的連接。

    ①制備粗酶液稱(chēng)取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性為，胰淀粉酶活性為，胰脂肪酶活性為。將其用pH值為、濃度為0．2mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，然后進(jìn)行真空過(guò)濾，收集濾液并用磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)挂鹊鞍酌富钚詾?-10U/mg，備用。②制備反膠束將AOT置于100℃烘箱中干燥至恒重，放入干燥器中冷卻至室溫。然后稱(chēng)取，加入10L異辛烷，在攪拌下使其形成均勻的分散液，再加入定量蒸餾水，在200r/min的轉(zhuǎn)速下處理2h，獲得濃度為。使用時(shí)用異辛烷稀釋10倍。③萃取將稀釋10倍的AOT-異辛烷反膠束置于萃取器中，按照AOT異辛烷反膠束：粗酶溶液體積比為（2-3):1的比例加入粗酶溶液萃取3-4次，，在300-400r/min的轉(zhuǎn)速下萃取5-10min。如此每次萃取完成后，均進(jìn)行離心分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000-6000r/min，時(shí)間10-15min收集、合并離心上層清液，進(jìn)行反萃取，下層萃余液用于制備胰脂肪酶。④反萃取將荷載胰蛋白酶的AOT-異辛烷反膠束置于萃取器中，在攪拌下加入等體積的反萃取液進(jìn)行反萃取15-20min萃取液為0．。如此反萃取3次，每次萃取完成后，均進(jìn)行離心分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000-6000r/min,時(shí)間為15-20min。分別收集、合并離心上層清液和下層反萃取液，前者再生后可再次萃取胰蛋白酶。 細(xì)胞消化時(shí)，胰酶不去除對(duì)細(xì)胞的影響？

    胰蛋白酶用法用量1.每次～5mg，用蒸餾水5～10ml溶解。2.一般應(yīng)用：1次5000單位，每日1次肌注，用量酌情而定。為防止疼痛，可加適量普魯卡因。局部用*視情而定，可配成溶液制劑（～，微堿性時(shí)活性**強(qiáng)）、噴霧劑、粉劑、油膏等，用作體腔內(nèi)注射、患部注射、噴霧、濕敷、涂搽等。3.治蛇毒：取注射用結(jié)晶胰蛋白酶2000單位1～3支，加～（或注射用水）4～20ml稀釋?zhuān)匝篮蹫橹行?，在傷口周?chē)鹘?rùn)注射，或在腫脹部位上方作環(huán)狀封閉1～2次。如病情需要可重復(fù)使用。若傷肢腫脹明顯，可于注射本品30分鐘后，切開(kāi)傷口排毒減壓（嚴(yán)重出血者例外），也可在腫脹部位針刺排毒。如傷口已壞死、潰爛，可用其***胰蛋白酶注意事項(xiàng)1.不可作靜注。用前需作劃痕試驗(yàn)，應(yīng)注意可能產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。2.吸取注射液后應(yīng)另?yè)Q針頭，以免注射時(shí)疼痛。3.外用時(shí)，可采用注射用制劑以緩沖液溶解，但必須在3小時(shí)內(nèi)用畢。胰蛋白酶不良反應(yīng)：1．注射局部疼痛、硬結(jié)。2．本品可引起組胺釋放，產(chǎn)生全身反應(yīng)，有寒戰(zhàn)、發(fā)熱、***、頭暈、胸痛、***、皮疹、血管神經(jīng)性水腫、呼吸困難、眼壓升高、白細(xì)胞減少等。癥狀輕時(shí)不影響繼續(xù)***，給予抗組胺*和對(duì)癥*物即可控制，嚴(yán)重時(shí)應(yīng)即停*。3．本品偶可致過(guò)敏性休克。不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大，通常以消化后可以充分打散組織為宜。廣西胰酶常見(jiàn)問(wèn)題

如果消化液中含有胰酶和EDTA，好去除。廣西胰酶常見(jiàn)問(wèn)題

胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37°℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力**強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如:D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。廣西胰酶常見(jiàn)問(wèn)題