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來源: 發(fā)布時間:2022-01-24

配合雙光子激發(fā)技術,激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,什么是雙光子激發(fā)技術呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,經(jīng)過一個很短的時間后,電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,便誕生了雙光子激發(fā)技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),產(chǎn)生熒光,該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,被光探頭接收,從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中;ultima2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話

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在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面(感光元件)上,所以其成像是整個樣品的重疊像,沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光,分辨率有了本質(zhì)上的提高,擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力,可以進行三維成像、動態(tài)成像等。然而,***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度,需要加大激發(fā)光功率,這又會導致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應,與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學散射,其具體優(yōu)勢如下。美國雙光子顯微鏡成像視野在深度組織中以較長時間對細胞成像,雙光子顯微鏡是當前之選。

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和很多偉大的科學發(fā)明一樣,雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然,但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經(jīng)科學帶來了一種**性的成像技術:雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初,當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時,他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書,從中了解到非線性光學效應——強光和物質(zhì)的相互作用。當時,Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件,于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,換言之,與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子,通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,Denk聯(lián)合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。

雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例;生物領域:貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子動力學情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領域:美國科學家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點,避免了層與層之間的互相干擾,較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度。雙光子顯微鏡已延伸到各個領域研究中,它能對樣品進行三維觀察,其基礎雙光子激發(fā)效應也具有極高的應用價值。我們可以相信,隨著科技不斷發(fā)展,其他技術的不斷結合,雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應用。雙光子顯微鏡使用方法是什么?

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Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態(tài)后,雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是,霍華德·休斯醫(yī)學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡,其成像視場達到5毫米,能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像。根據(jù)清華大學單一采購來源的**指導意見:這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來,雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子,這種非線性成像技術通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,發(fā)展速度可見一斑。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經(jīng)細胞的形態(tài)結構、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監(jiān)測。國內(nèi)雙光子顯微鏡光子躍遷

對于顯微成像技術包含:寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,這一波段的光對細胞和組織的光損傷小,適用于長時間的研究;☆穿透能力強:相對于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi);☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學濾波器(共焦),這樣就提高了對熒光的收集率,而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高;☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16,降低了散射的干擾;☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究;ultima2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話