清醒動物多光子顯微鏡長時間觀察

來源: 發(fā)布時間:2024-12-18

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發(fā)光,對細(xì)胞和組織的光損傷很小,適合于長時間的研究;b.穿透能力強(qiáng)∶相對于紫外光,可見光或近紅外光具有很強(qiáng)的穿透性,可以對生物樣品進(jìn)行深層次的研究;c.高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收局限于焦點處的體積約為λ范圍內(nèi);d.漂白區(qū)域很小,焦點以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。e.熒光收集率高。與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學(xué)濾波器,提高了熒光收集率。收集效率提高直接導(dǎo)致圖像對比度提高。f.對探測光路的要求低。由于激發(fā)光與發(fā)射熒光的波長差值加大以及自發(fā)的三維濾波效果,多光子顯微鏡對光路收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低得多,光學(xué)系統(tǒng)相對簡單。g.適合多標(biāo)記復(fù)合測量。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)譜寬闊,這樣,可以利用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料,從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息,便于相互對照、補(bǔ)充。多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實驗方法,三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力。清醒動物多光子顯微鏡長時間觀察

清醒動物多光子顯微鏡長時間觀察,多光子顯微鏡

單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光,是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu),其目的是為了,通過共焦結(jié)構(gòu),提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同,實現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡(沒有共焦結(jié)構(gòu))其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統(tǒng),相對來說,就提高了激發(fā)光源的利用率,以及熒光的探測效率,這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu),分辨率則會更高,而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。布魯克多光子顯微鏡焦點激發(fā)從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看,正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。

清醒動物多光子顯微鏡長時間觀察,多光子顯微鏡

多光子顯微鏡成像深度深、對比度高,在生物成像中具有重要意義,但通常需要較高的功率。結(jié)合時間傳播的超短脈沖可以實現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度,但近紅外波段的光本身會導(dǎo)致分辨率較低?;诙喙庾由限D(zhuǎn)換材料和時間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學(xué)教授和北京大學(xué)彭研究員合作開發(fā)的??蓪崿F(xiàn)50MHz的超高掃描速度,突破衍射極限,實現(xiàn)超分辨率成像。與普通熒光顯微鏡相比,該顯微鏡經(jīng)過改進(jìn),只需要較低的激發(fā)功率。這種超快、低功耗、多光子超分辨率技術(shù)在高分辨率生物深層組織成像中具有長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看,正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。2020年,全球多光子激光掃描正置顯微鏡市場達(dá)到87.30百萬美元,預(yù)計到2027年該部分市場將達(dá)到154.02百萬美元,年復(fù)合增長率(2021-2027)為8.48%。中國多光子激光掃描正置顯微鏡市場達(dá)到13.32百萬美元,預(yù)計到2027年該部分市場將達(dá)到25.21百萬美元,年復(fù)合增長率(2021-2027)為9.58%。從產(chǎn)品市場應(yīng)用情況來看,研究機(jī)構(gòu)為主要應(yīng)用領(lǐng)域,2020年約占全球市場46.28%。2020年,全球多光子激光掃描顯微鏡研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用消費量為174臺,預(yù)計2027年達(dá)到349臺,2021-2027年復(fù)合增長率(CAGR)為9.72%。多光子激光掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問題, 擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。

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光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問題提供了條件與可能。因此,在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上,急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在動物體內(nèi),如何實現(xiàn)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)之間相五作用的實時在體成像監(jiān)測是當(dāng)前迫切需要解決的重大科學(xué)技術(shù)問題。這是也生物學(xué)、信息科學(xué)(光學(xué))和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大問題。對這-一一科學(xué)問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律、認(rèn)識疾病的發(fā)展規(guī)律,而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)等產(chǎn)生重大影響。多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)、工程學(xué)等學(xué)科,生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜,進(jìn)入門檻較高。美國靈長類多光子顯微鏡成像精度

多光子顯微鏡的分辨率比傳統(tǒng)的單光子共聚焦要低的多。清醒動物多光子顯微鏡長時間觀察

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時,隨著刺激時間的增加,即使繼續(xù)刺激,Ca2+熒光信號也不會繼續(xù)增強(qiáng),反而會減弱,直至恢復(fù)到無刺激時的水平。對于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化,發(fā)現(xiàn)粘附過程中Ca2+熒光信號沒有變化,但當(dāng)配子融合時,Ca2+熒光信號強(qiáng)度出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值,持續(xù)數(shù)分鐘。這些現(xiàn)象對于研究受精發(fā)育的早期信號以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中,如細(xì)胞分裂和胞吐,Ca2+熒光信號的強(qiáng)度也會發(fā)生很大的變化。清醒動物多光子顯微鏡長時間觀察