深圳熒光顯微鈣成像聯(lián)系方式

霍華德休斯頓醫(yī)學(xué)研究所（HHMI）ScottSternson課題組研究了影響這種源源不斷的食欲的神經(jīng)機(jī)制。他們通過(guò)使用Inscopix小顯微鏡觀察小鼠腦干區(qū)域的神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)貪念美食的小鼠可能是因?yàn)樘厥獾拇竽X區(qū)域?qū)γ朗澈湍滩璞绕渌∈蟾用舾?。本能?huì)驅(qū)使我們?cè)诟械金囸I和干渴的時(shí)候?qū)ふ沂澄?，在找到食物或水時(shí)通過(guò)眼睛看、鼻子聞、嘴巴嘗等方式來(lái)感受和決定要不要吃，吃到一定程度產(chǎn)生滿足感（或是吃了還想吃的不滿足感）。因此，要把大腦中匯集的關(guān)于吃喝的各類信號(hào)分清楚，并找出控制不同吃喝行為的神經(jīng)環(huán)路無(wú)疑是很有挑戰(zhàn)的任務(wù)。ScottSternson博士的研究團(tuán)隊(duì)在小鼠大腦中尋找饑餓和干渴神經(jīng)環(huán)路共存的腦區(qū)。他們注意到，腦干的藍(lán)斑區(qū)（locuscoeruleus）附近有一群谷氨酸能神經(jīng)元（被稱為periLC神經(jīng)元），參與進(jìn)食和飲水的行為，是餓和渴的匯聚點(diǎn)。為了研究這些神經(jīng)細(xì)胞的功能，研究小組開發(fā)了一種技術(shù)，可以讓小鼠在自由活動(dòng)的同時(shí)，通過(guò)Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微鏡觀察記錄腦干中periLC神經(jīng)元的活動(dòng)。這項(xiàng)研究的作者龔蓉博士表示，解決這個(gè)技術(shù)是此項(xiàng)研究的關(guān)鍵。通過(guò)鈣成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的活動(dòng)與其內(nèi)部的鈣離子濃度密切相關(guān)。深圳熒光顯微鈣成像聯(lián)系方式

對(duì)于成像和長(zhǎng)時(shí)間成像，較重要的是要保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。熒光團(tuán)受激發(fā)光光照后產(chǎn)生的氧化物質(zhì)與蛋白質(zhì)、核酸和脂肪等發(fā)生反應(yīng)，熒光信號(hào)降低的同時(shí)（光致退色）也降低了細(xì)胞壽命（光線損傷）。在光照過(guò)程中氧化劑的產(chǎn)生,主要決定于熒光團(tuán)的光化學(xué)性質(zhì)和光照劑量,因此減少光照劑量成為解決上述問(wèn)題的途徑之一。光漂白（Photobleaching）指在光的照射下熒光物質(zhì)所激發(fā)出來(lái)的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間推移逐步減弱乃至消失的現(xiàn)象。熒光成像的質(zhì)量很大程度上依賴于熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高激發(fā)光強(qiáng)度固然可以提高信號(hào)強(qiáng)度，但激發(fā)光的強(qiáng)度不是可以無(wú)限提高的，當(dāng)激發(fā)光的強(qiáng)度超過(guò)一定限度時(shí)，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子，這就是光漂白現(xiàn)象。在顯微技術(shù)中，光漂白使得觀測(cè)變得很復(fù)雜，因?yàn)樗鼤?huì)造成破壞，使螢光團(tuán)無(wú)法繼續(xù)放光，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。南京inscopix鈣成像供應(yīng)商雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行活動(dòng)動(dòng)物成像的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。

目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元，觀察對(duì)象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位相關(guān)性的活動(dòng)。第三種也較為常用，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細(xì)胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）

近年來(lái)出現(xiàn)了通過(guò)植入性的microscope或microlens進(jìn)行freelymoving動(dòng)物鈣成像的技術(shù)。如光纖成像法：使用一端帶有GRINlens的光纖連接顯微鏡和動(dòng)物大腦，從特定腦區(qū)發(fā)出的熒光信號(hào)被光纖收集，然后通過(guò)相機(jī)成像。動(dòng)物頭部只需植入GRINlens，方便活動(dòng)，而且可以同時(shí)植入多個(gè)lens來(lái)觀察不同的腦區(qū)之間的聯(lián)系和相互作用。還有直接植入動(dòng)物大腦的微型熒光顯微鏡，將GRINlens直接植入皮層下的海馬，下丘腦，丘腦等區(qū)域，可以監(jiān)測(cè)深部腦區(qū)的神經(jīng)元活動(dòng)。這種微型顯微鏡的重量只有幾克，不會(huì)影響動(dòng)物自由活動(dòng)，可以提供800μm600μm視野和1.50μm橫向分辨率。鈣成像系統(tǒng)集成自動(dòng)控制和精確計(jì)時(shí)的多模式輸入端口。

在生物有機(jī)體，鈣離子產(chǎn)生各種各樣的胞內(nèi)信號(hào)，這些胞內(nèi)信號(hào)幾乎在每種類型的細(xì)胞中都存在，且在很多功能方面有重要作用，例如對(duì)心肌細(xì)胞收縮的控制和從細(xì)胞增殖到細(xì)胞死亡整個(gè)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等。在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子是一類重要的神經(jīng)元胞內(nèi)信號(hào)分子。在靜息狀態(tài)下，大部分神經(jīng)元的胞內(nèi)鈣離子濃度為50-100nM，而當(dāng)神經(jīng)元活動(dòng)的時(shí)候，胞內(nèi)鈣離子濃度能上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于包含有神經(jīng)遞質(zhì)的突觸囊泡的胞吐釋放過(guò)程必不可少。也就是說(shuō)神經(jīng)元的活動(dòng)與其內(nèi)部的鈣離子濃度密切相關(guān)，神經(jīng)元在放電的時(shí)候會(huì)爆發(fā)出一個(gè)短暫的鈣離子濃度高峰。神經(jīng)元鈣成像（calciumimaging）技術(shù)的原理就是借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針(鈣離子指示劑，calciumindicator)，將神經(jīng)元當(dāng)中的鈣離子濃度通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，從而達(dá)到檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的。用標(biāo)準(zhǔn)行為測(cè)定法進(jìn)行成像和行為實(shí)驗(yàn)的時(shí)間同步可進(jìn)行深部腦區(qū)鈣成像。熒光顯微鈣成像

想要同時(shí)觀察軸突和樹突的鈣離子信號(hào)，大視野是很重要的。深圳熒光顯微鈣成像聯(lián)系方式

目前可用的指示劑較多，根據(jù)熒光光譜、與鈣離子親和力及其化學(xué)特性的不同大致分為化學(xué)性鈣離子指示劑和基因編碼鈣離子指示劑。前者指可特異性與鈣離子結(jié)合的小分子，常用的有fura-2、indo-1等；而后者主要指來(lái)源于綠色熒光蛋白GFP及其變異體的蛋白質(zhì)，可與鈣調(diào)蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合，常用的有GCaMP、TN-XXL等，其中GCaMP5G和GCaMP6被廣泛應(yīng)用于在體鈣成像研究中。生物熒光蛋白：Aequorin是水母熒光素（coelenterazine）通過(guò)硫酸酯鍵或過(guò)氧化鍵緊緊連到脫輔水母發(fā)光蛋白上形成的，遇到鈣離子就發(fā)出470nm藍(lán)光，可以作為鈣離子的檢測(cè)試劑；化學(xué)鈣離子指示劑：Fura-2可在紫外光下被jihuo且發(fā)射出505-520nm光；基于FRET的基因編碼的鈣指示劑；單個(gè)熒光基因編碼的鈣指示劑。深圳熒光顯微鈣成像聯(lián)系方式