熒光激光雙光子顯微鏡應(yīng)用

宇宙，浩瀚無(wú)垠，在數(shù)百億光年可觀測(cè)的空間里閃爍著上萬(wàn)億個(gè)星系。人類1400克的大腦,如同一個(gè)小小的宇宙，包含了百億級(jí)神經(jīng)元和百萬(wàn)億級(jí)的神經(jīng)突觸，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接，涌現(xiàn)出意識(shí)和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘。新千年伊始，世界科技強(qiáng)國(guó)紛紛啟動(dòng)有史以來(lái)比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計(jì)劃，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開(kāi)。工欲善其事，必先利其器。目前，各國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃的一個(gè)重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的活動(dòng)和個(gè)體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率。熒光激光雙光子顯微鏡應(yīng)用

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù)，可以在保持細(xì)胞活性的情況下，對(duì)深層組織進(jìn)行高分辨率成像。它主要用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究。雙光子顯微鏡的重心技術(shù)是基于雙光子激發(fā)的熒光成像。當(dāng)激光通過(guò)樣品時(shí)，它會(huì)吸收特定波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個(gè)連續(xù)的光子同時(shí)激發(fā)樣品，這樣可以在保持樣品完整性的同時(shí)，獲得高質(zhì)量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無(wú)法對(duì)深層組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗梢约ぐl(fā)樣品的深層熒光。3.活細(xì)胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細(xì)胞活性的情況下進(jìn)行成像，這對(duì)于研究細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程非常有用。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結(jié)合多種技術(shù)，如光譜成像、鈣離子成像和神經(jīng)活動(dòng)成像等，以提供更豐富的生物樣品信息?？傊?，雙光子顯微鏡是一種強(qiáng)大的研究工具，可以對(duì)深層組織和活細(xì)胞進(jìn)行無(wú)損成像。這使得它在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究中具有廣泛的應(yīng)用。ultimainvestigator雙光子顯微鏡廠家雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，還有一些短波長(zhǎng)可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。

美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在JaneliaFarmResearchCampus的吉娜博士小組與來(lái)自中科院上海光機(jī)所強(qiáng)場(chǎng)激光物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過(guò)校正小鼠大腦的像差，在視覺(jué)皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號(hào)強(qiáng)度，明顯改進(jìn)了成像質(zhì)量，使得原來(lái)在鼠腦中不可見(jiàn)或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見(jiàn)，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺(jué)皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實(shí)。這一成果發(fā)表在較新一期的《NatureMethods》。

目前，世界各國(guó)的腦科學(xué)研究如火如荼，中國(guó)的腦計(jì)劃也即將啟動(dòng)。其中，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究成為重點(diǎn)研究方向，而如何打破尺度壁壘，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的信息處理和個(gè)體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系、工學(xué)院以及中國(guó)人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報(bào)道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍，同時(shí)具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運(yùn)動(dòng)行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像，并且實(shí)現(xiàn)了針對(duì)同一批神經(jīng)元長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)是。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點(diǎn)，大致可以分為兩個(gè)方面:深入和主動(dòng)改進(jìn)。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個(gè)方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細(xì)，集中能量，讓激光穿透得更深。對(duì)于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過(guò)電泳電解脂類，從而提高標(biāo)本的“透明度”。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。ultima雙光子顯微鏡成像視野是多少

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配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。熒光激光雙光子顯微鏡應(yīng)用