模塊化多光子顯微鏡實驗操作

單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在10s左右。這時它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時，就發(fā)射熒光。因為在發(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長。多光子顯微鏡，提高樣品成像質(zhì)量，降低樣品損害程度。模塊化多光子顯微鏡實驗操作

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進步，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞模型，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用、細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常有必要的。Ultima 2P Plus多光子顯微鏡成像區(qū)域多光子顯微鏡是一款針對厚樣本進行深層成像的利器,特別是在實驗中。

    對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠程對焦時對反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描，以實現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實現(xiàn)這種設(shè)計。***個可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個垂直臂組成，每個臂具有4F望遠鏡和物鏡。遠程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進入遠程聚焦臂，由GSM進行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點可以進行水平掃描。由于雙光子激發(fā)的特性，它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像。多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。美國靈長類多光子顯微鏡單分子成像定位

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。模塊化多光子顯微鏡實驗操作

    2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描；但是，遠程聚焦中反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球面像差和更高階像差，從而無法進行高分辨率成像。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描。該設(shè)計有兩種實現(xiàn)方式，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進行連續(xù)的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示，由兩個垂直臂組成，每個臂中都有一個4F望遠鏡和一個物鏡。遠程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1），另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個臂對齊，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直的激光束被偏振分束器反射到遠程聚焦臂中，GSM對其進行掃描，進而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點進行橫向掃描。 模塊化多光子顯微鏡實驗操作