日本多通道膜片鉗離子電流

內(nèi)面向外膜片(inside-outpatch)高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。此時膜片兩側(cè)的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位，膜電位等于玻管電位的負值。如放大器的電流監(jiān)視器輸出是非反向的，則輸出將與膜電流(Im)的負值相等。外面向外膜片(out-sidepatch)高阻封接形成后，繼續(xù)以負壓抽吸，膜片破裂再將玻管慢慢地從細胞表面垂直地提起，斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層，此時高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。這種膜片形式應測膜片電阻，并消除漏電流和電容電流。整個過程要當心是否形成囊泡。如果浴槽保持地電位水平，膜電位即與玻管電位相等。如放大器是非反向的，放大器的輸出將與Im值相等。屯流鉗素向細胞內(nèi)注入刺激電流，記錄膜電位對刺激電流的反應。日本多通道膜片鉗離子電流

電壓鉗的缺點∶電壓鉗技術目前主要用于巨火細胞的全細胞電流研究，特別在分子克隆的卵母細胞表達電流的鑒定中發(fā)揮其它技術不能替代的作用。但也有其致命的弱點1、微電極需刺破細胞膜進入細胞，以致造成細胞漿流失，破壞了細胞生理功能的完整性;2、不能測定單一通道電流。因為電壓鉗制的膜面積很大，包含著大量隨機開放和關閉著的通道，而且背景噪音大，往往掩蓋了單一通道的電流。3、對體積小的細胞（如哺乳類***元，直徑在10-30μm之間）進行電壓鉗實驗，技術上有更大的困難。由于電極需插入細胞，不得不將微電極的前列做得很細，如此細的前列致使電極阻抗很大，常常是60～-8OMΩ或120～150MΩ（取決于不同的充灌液）。這樣大的電極阻抗不利于作細胞內(nèi)電流鉗或電壓鉗記錄時在短時間（0.1μs）內(nèi)向細胞內(nèi)注入電流，達到鉗制膜電壓或膜電流之目的。再者，在小細胞上插入的兩根電極可產(chǎn)生電容而降低測量電壓電極的反應能力。全自動膜片鉗電流鉗制小片膜的孤立使對單個離子通道進行研究成為可能。

膜片鉗技術實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪聲水平降低，相對地增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。另外，它還具有良好的機械穩(wěn)定性和化學絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進行研究成為可能。單通道電流1.典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化。他有兩個電導水平，即O和1，分別對應通道的關閉和開效狀態(tài)。2.有的矩形脈沖簇狀發(fā)放時，通道電流不在同一水平，可以明顯觀察到不同數(shù)目離子通道所形成的電流臺階，從而可推斷出被測膜片的通道數(shù)目。3.有的通道可記錄到圓滑型和方波形兩種形式。4.有些通道開放活動是持續(xù)開放，中間被閃動樣的關閉所中斷，形成burst開放。有些通道開放活動是簇狀開放與短期平靜交替出現(xiàn)，形成簇狀發(fā)放串（Cluster）

膜片鉗技術本質(zhì)上也屬于電壓鉗范疇，兩者的區(qū)別關鍵在于：①膜電位固定的方法不同；②電位固定的細胞膜面積不同，進而所研究的離子通道數(shù)目不同。電壓鉗技術主要是通過保持細胞跨膜電位不變，并迅速控制其數(shù)值，以觀察在不同膜電位條件下膜電流情況。因此只能用來研究整個細胞膜或一大塊細胞膜上所有離子通道活動。目前電壓鉗主要用于巨大細胞的全性能電流的研究，特別在分子克隆的卵母細胞表達電流的鑒定中發(fā)揮著其他技術不能替代的作用。該技術的主要缺陷是必須在細胞內(nèi)插入兩個電極，對細胞損傷很大，在小細胞如元，就難以實現(xiàn)，又因細胞形態(tài)復雜，很難保持細胞膜各處生物特性的一致。在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh啟動的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術。

80年代初發(fā)展起來的膜片鉗技術(patchclamptechnique)為了解生物膜離子單通道的門控動力學特征及通透性、選擇性膜信息提供了直接的手段。該技術的興起與應用，使人們不僅對生物體的電現(xiàn)象和其他生命現(xiàn)象更進一步的了解，而且對于疾病和藥物作用的認識也不斷的更新，同時還形成了許多病因?qū)W與藥理學方面的新觀點。膜片鉗技術是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的或多個的離子通道分子活動的技術。它和基因克隆技術（genecloning）并架齊驅(qū)，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來。美國雙分子層膜片鉗系統(tǒng)

對離子通道功能的研究，主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能。日本多通道膜片鉗離子電流

把膜電位鉗位電壓調(diào)到-80--100mV，再用鉗位放大器的控制鍵把全細胞瞬態(tài)充電電流調(diào)定至零位（EPC-10的控制鍵稱為C-slow和C-series;Axopatch200標為全細胞電容和系列電阻）。寫下細胞的電容值Cc和未補整的系列電阻值Rs，用于消除全細胞瞬態(tài)電流，計算鉗位的固定時間（即RsCc），然啟根據(jù)歐姆定律從測定脈沖電流的振幅算出細胞的電阻RC。緩慢調(diào)節(jié)Rs旋鈕注意測定脈沖反應的變化，逐漸增加補整的比例。如果RS補整非常接近振蕩的閾值，RS或Cc的微細變化都會達到震蕩的閾值，產(chǎn)生電壓的振蕩而使細胞受損。因此應當在RS補整水平寫不穩(wěn)定閾值之間留有10%-20%的余地為安全。準備資料收集和脈沖序列的測定。日本多通道膜片鉗離子電流

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