美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達(dá)到5毫米，能夠跨多個腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見一斑。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國智造”隊伍。目前，該研發(fā)團(tuán)隊正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動的中國腦科學(xué)計劃?？梢云诖?，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用美國investigator雙光子顯微鏡掃描深度雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點(diǎn)的信號被探測。通過點(diǎn)掃描的方式，一個個點(diǎn)的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn)，出才會激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點(diǎn)的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細(xì)胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。

實驗從理論和實驗上評估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率。雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點(diǎn)的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、有生命體的觀察！美國熒光激光雙光子顯微鏡原理

儀器儀表行業(yè)本身是一個加入，產(chǎn)出周期較長的行業(yè)，所以作為業(yè)內(nèi)廠家，一方面要尋找中、短期市場熱點(diǎn)，另一方面也要在產(chǎn)品、技術(shù)研發(fā)方面有長遠(yuǎn)的規(guī)劃;目前，nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo等產(chǎn)品的產(chǎn)量居世界前列，實驗分析儀器等中產(chǎn)品的市場占比不斷上升，行業(yè)技術(shù)上總體已達(dá)到的中等國際水平，少數(shù)產(chǎn)品接近或達(dá)到當(dāng)前較高國際水平。在國民經(jīng)濟(jì)運(yùn)行中，生物科技，醫(yī)藥科技領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)開發(fā)、技術(shù)咨詢、技術(shù)服務(wù)、技術(shù)轉(zhuǎn)讓，實驗室設(shè)備、儀器儀表、醫(yī)療器械、計算機(jī)、軟件及輔助設(shè)備銷售，計算機(jī)數(shù)據(jù)處理，貨物及技術(shù)進(jìn)出口業(yè)務(wù)。 成像平臺： 1. Inscopix自由活動超微顯微成像系統(tǒng) 2. DiveScope多通道內(nèi)窺鏡系統(tǒng) 3. 雙光子顯微鏡 動物行為學(xué)平臺： 1. PiezoSleep無創(chuàng)睡眠檢測系統(tǒng) 2. 自身給藥、條件恐懼、斯金納、睡眠剝奪、跑步機(jī)、各類經(jīng)典迷宮等 神經(jīng)電生理： 1.NeuroNexus神經(jīng)電極 2.多通道電生理信號采集系統(tǒng) 3.膜片鉗系統(tǒng) 4.AO功能神經(jīng)外科臨床電生理平臺 顯微細(xì)胞： 1. UnipicK單細(xì)胞挑選及顯微切割系統(tǒng) 科研/臨床級3D打印 1. 德國envisionTEC 3D Bioplotter生物打印機(jī) 2. 韓國Invivo醫(yī)療級生物打印機(jī)等。等設(shè)備是提高勞動生產(chǎn)率的倍增器，對國民經(jīng)濟(jì)有著巨大的作用和影響力。美國商業(yè)部地區(qū)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)研究院（NIST）提出的報告稱：美國90年代儀器儀表工業(yè)產(chǎn)值只占工業(yè)總產(chǎn)值的4%，但它對國民經(jīng)濟(jì)（GNP）的影響面卻達(dá)到66%。盡管在我國相關(guān)政策的引導(dǎo)和支持下，我國儀器儀表行業(yè)得到了飛速發(fā)展。但是從銷售整體上看，我國的儀器儀表行業(yè)還是落后于國際水平的。重點(diǎn)技術(shù)缺乏、高精尖產(chǎn)品嚴(yán)重依賴進(jìn)口、儀器儀表產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重、生產(chǎn)工藝落后、研發(fā)能力弱、精度不高等問題的凸顯，為儀器儀表行業(yè)的發(fā)展帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。美國熒光激光雙光子顯微鏡原理