原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)有什么區(qū)別:一、定義不同:1、原代培養(yǎng)是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的開始培養(yǎng),也叫初代培養(yǎng)。2、傳代培養(yǎng)是指需要將培養(yǎng)物分割成小的部分,重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi),再進(jìn)行培養(yǎng)的過程。對單層培養(yǎng)而言,80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。二、特點(diǎn)不同:1、原代細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。由于培養(yǎng)的細(xì)胞剛剛從組織分離出來,故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。2、當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和細(xì)胞不斷分裂,一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性克制,生長速度減慢甚至停止;另一方面也會(huì)因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞。原代細(xì)胞分離試劑盒廠家批發(fā)價(jià)
膠原酶的配制:建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱(注意現(xiàn)用現(xiàn)配)。胰酶(酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶,相關(guān)文章也蠻多的)膠原酶消化時(shí)間:根據(jù)組織特性,消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例,加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后,放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,期間每10min中震蕩一次,知道組織塊幾乎完全消失為止(若是組織塊剪得非常細(xì)小,時(shí)間可以短一些,30min左右即可)。原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶。成都原代細(xì)胞分離試劑盒推薦廠家原代細(xì)胞是出了名的難養(yǎng),對培養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作的要求更苛刻。
選擇原代細(xì)胞的原因:長期以來,科學(xué)家多依賴永生化的細(xì)胞系來進(jìn)行各種研究,但在過去十年,隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域發(fā)生了巨大變化,新型的技術(shù)和培養(yǎng)試劑讓使用原代細(xì)胞作為研究對象成為可能。相比于細(xì)胞系,原代細(xì)胞更多保留了體內(nèi)原始組織的生物學(xué)特征,如生長和衰老,因此通過原代細(xì)胞可建立更好的細(xì)胞疾病模型。原代細(xì)胞(Primarycells)是指來源組織,經(jīng)過特定分離方法制備而成的初始細(xì)胞。原代細(xì)胞離體時(shí)間短且不經(jīng)過永生化過程,其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍保持原有的遺傳特征,可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀態(tài),從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù),很適合用于藥物測試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。
原代細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng):由于每種原代細(xì)胞培養(yǎng)的條件迥異,而且每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都摸索出自己的培養(yǎng)條件,而對于一個(gè)特定的組織塊,所用培養(yǎng)條件不一樣,得出的所需細(xì)胞族群就不一樣,因?yàn)槊糠N組織塊都含有不同種類的細(xì)胞群,而每一種細(xì)胞群在所選定的培養(yǎng)條件下(比如所選蛋白分解酶的種類和條件,細(xì)胞因子的種類,基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類或者是培養(yǎng)時(shí)間長短)都會(huì)得出不同的結(jié)果。由于各實(shí)驗(yàn)室采取不同的培養(yǎng)條件,即使是同一塊心組織就有可能造成A實(shí)驗(yàn)室獲得30%的心肌細(xì)胞,70%其他種類細(xì)胞,而B實(shí)驗(yàn)室卻能獲得70%所需心肌細(xì)胞,30%為成纖維、脂肪等種類。這樣的話,即使是做同一項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn),就有可能得出相反的科學(xué)結(jié)論。因此,早在2004年,美國科學(xué)界就質(zhì)疑之前以原代細(xì)胞為主的科研文章,并同時(shí)提出原代細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)的概念會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。
細(xì)胞傳代的方法都有哪些:根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。原代培養(yǎng)的開始傳代應(yīng)注意的問題?細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長,不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間,因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理,并根據(jù)不同細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞;吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對細(xì)胞的損傷;開始傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些,使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值;隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上,可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。深圳正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒直銷廠家
它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長。原代細(xì)胞分離試劑盒廠家批發(fā)價(jià)
原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟(以24孔培養(yǎng)板為例):A.細(xì)胞接種:轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種細(xì)胞,每孔500μl培養(yǎng)基(不可加物品),使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備:1.6pmolsiRNA用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻,室溫孵育5min。注意:確保在25min內(nèi)執(zhí)行第三步操作,不要過于延遲。3.孵育5min后,將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合(總體積100μl)。輕輕混勻,室溫孵育20min。C.將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)(完全培養(yǎng)基培養(yǎng)):1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi),培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板,混勻。2.37°C培養(yǎng)18-72h,檢測基因克制效果。如果需要,細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時(shí)可以更換培養(yǎng)基,但不是必須。孵育時(shí)間的長短,取決于細(xì)胞類型、所干擾基因本身及分析方法??稍O(shè)置不同的孵育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定較佳孵育時(shí)間。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)優(yōu)化:為了提高轉(zhuǎn)染效率,較好對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化,特別是開始使用。原代細(xì)胞分離試劑盒廠家批發(fā)價(jià)