溫州昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-07-13

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清:不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。較好是在靠前次實(shí)驗(yàn)前做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn),比如:HeLa,293,CHO,COS7,MCF-7,HepG2等細(xì)胞,是否加血清,對不同的細(xì)胞是有不同的影響的,有些細(xì)胞是可以有血清的,有些加血清就會(huì)受影響。轉(zhuǎn)染后在6小時(shí)左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基,其一因?yàn)槠胀ㄞD(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性作用大,其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡。轉(zhuǎn)染時(shí)不加血清是防止血清的干擾作用,轉(zhuǎn)染后可適時(shí)加入。加入過早會(huì)引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢生長,過晚會(huì)引起較多細(xì)胞死亡。可實(shí)時(shí)觀察1/5細(xì)胞變圓的時(shí)候加入血清。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷。溫州昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧:一、脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分普遍,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn):與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復(fù)性,它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前條件下較方便的轉(zhuǎn)染方法之一濟(jì)南細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的。

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轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):培養(yǎng)基中的物品物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因?yàn)檫@些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明,對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,可在48h-72h細(xì)胞長滿之后,提取細(xì)胞蛋白或者RNA。

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑:1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下,還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn),盡量使用開封半年內(nèi)的,因?yàn)檫^了半年后,就算沒有過失效期,但是細(xì)胞毒性較大增加,而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn),其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個(gè)時(shí)候,較好不要換液,不要打擾細(xì)胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話,會(huì)引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長。那么,什么是較佳時(shí)機(jī)呢?在20%的細(xì)胞變圓的時(shí)候,就是加血清的較佳時(shí)機(jī)。陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑,以其適用宿主范圍廣。廈門太原細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

對于貼壁細(xì)胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,用胰酶處理為單細(xì)胞懸液。溫州昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。分為物理介導(dǎo)方法:電穿孔法、顯微注射和基因;化學(xué)介導(dǎo)方法:如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù);生物介導(dǎo)方法:有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢。但是細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,常常對細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點(diǎn)。需要指出的一點(diǎn),無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),要獲得較優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果,可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)。溫州昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑