細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清:傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑一般會增加細(xì)胞的通透性,這樣會把血清中的成分帶入細(xì)胞,造成細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)體,轉(zhuǎn)染的過程是帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。血清中含有大量的蛋白質(zhì),在轉(zhuǎn)染過程中,帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體對核酸的吸附,影響轉(zhuǎn)染效率。同時,也會將血清中的蛋白帶入細(xì)胞,引發(fā)細(xì)胞毒性,故不能有血清轉(zhuǎn)染。這些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后4-6h在更換成有血清培養(yǎng)基,這其實是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率的降低。大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋。成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響因素:1.細(xì)胞密度一般來說,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%~80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率,過低或過高都會影響轉(zhuǎn)染效果。2.細(xì)胞生長狀態(tài)這點非常關(guān)鍵,很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此,為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性,應(yīng)盡量使用適度傳代的細(xì)胞系,并在不同次實驗時保持細(xì)胞傳代次數(shù)的一致性。3.細(xì)胞種類不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的,不能一種體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗。重慶正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜有血清時的轉(zhuǎn)染 血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染的注意事項:用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養(yǎng)基低得多)。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應(yīng)用的一種。在含血清時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基,無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞,可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含克制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分,在這些情況下,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1.細(xì)胞污染細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡,轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先,轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到較全無菌。毛博這里再貢獻(xiàn)一個獨門絕招:將提完質(zhì)粒后或者提的較后一步,用75%乙醇沉淀,這樣就除菌了。2.質(zhì)粒不行轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量,一般為2μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì),也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候,就應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響因素:1.細(xì)胞密度一般來說,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%~80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率,過低或過高都會影響轉(zhuǎn)染效果。2.細(xì)胞生長狀態(tài)這點非常關(guān)鍵,很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此,為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性,應(yīng)盡量使用適度傳代的細(xì)胞系,并在不同次實驗時保持細(xì)胞傳代次數(shù)的一致性。3.細(xì)胞種類不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的,不能一種體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點。深圳正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家
細(xì)胞易于生長到高密度并合成更多蛋白。成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗簡介:實驗原理外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法:電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細(xì)菌介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞;細(xì)菌法是利用包裝了外源基因的細(xì)菌傳染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴(yán)、難度較大;細(xì)菌法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系,一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法成都細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家