細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞狀態(tài)這點(diǎn)非常重要,不要急于求成,一定要讓細(xì)胞處于較佳的生長狀態(tài)再做。有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好,不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。或者,幾種來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售~再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。上海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)
轉(zhuǎn)染方式:細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,這對(duì)大分子物質(zhì)來說是個(gè)不可透過的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,其也帶負(fù)電荷。為了使核酸穿過細(xì)胞膜,研究人員開發(fā)了多種技術(shù),大致分為三類:化學(xué)方法---利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷。生物方法---利用基因工程細(xì)菌轉(zhuǎn)染非細(xì)菌基因到細(xì)胞中。物理方法---在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)的孔從而導(dǎo)入DNA。然而,沒有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn),理想的方法應(yīng)根據(jù)您的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇,理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率,低細(xì)胞毒性和對(duì)正常生理學(xué)的影響較小,并且易于使用和可重復(fù)性等特點(diǎn)。南京正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個(gè)報(bào)告基。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):血清A、DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不能含血清,因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。B、一般細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)可以耐受幾個(gè)小時(shí)沒問題,轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。C、對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,建議使用**轉(zhuǎn)染試劑。有條件的話,可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍,注意洗的時(shí)候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細(xì)胞而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面。如果洗的太厲害,細(xì)胞又損失一部分,加了脂質(zhì)體后,細(xì)胞受影響就更大了,死亡細(xì)胞會(huì)增多
細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟:1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。6.到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。
細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議:1.電場強(qiáng)度要合適合適的電場強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要,電場強(qiáng)度不能過高,過高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場強(qiáng)值,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場強(qiáng)度。2.細(xì)胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差,電轉(zhuǎn)后,細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng),而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA~蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的。南京正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)
表達(dá)水平與位臵無關(guān),不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。上海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)
如何提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率:優(yōu)化細(xì)胞生長狀態(tài)密切觀察您的細(xì)胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前,先制定一個(gè)適當(dāng)?shù)姆N板方案,使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持較佳狀態(tài)。增加成功幾率—細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過程中的一個(gè)關(guān)鍵元素,它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的較重要的變量。此外,還常用促有絲分裂刺激物(如,細(xì)菌轉(zhuǎn)化,生長因子,條件培養(yǎng)基,以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞—在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異明顯。天生趨于懸浮的細(xì)胞(如HL60,Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染。相反,天生為貼壁的細(xì)胞(如HEK,CHO)則可適應(yīng)懸浮生長的條件。上海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)