南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

來源: 發(fā)布時間:2022-08-20

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1.準(zhǔn)備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候,在開展正式實驗前要多做預(yù)試驗,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括:脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時候,如果電壓太大,往往會發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況。不同的細(xì)胞,需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實驗,多摸索條件。對于大多數(shù)細(xì)胞來說,其較佳電壓位于250-1250v/cm。另外,就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞的抗損傷能力是較強的。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6μg,如果﹥10μg,轉(zhuǎn)染效率也較大降低。電擊后,應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10分鐘,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。瞬時和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1-4天內(nèi)檢測到。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項:1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有毒害作用,細(xì)胞太少,容易死。一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml,確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比,在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系,如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細(xì)胞中CMV啟動子,而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。唐山正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷操作簡便,對細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.選擇傳代次數(shù)較低并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對大多數(shù)細(xì)胞而言,均需要在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在鋪板,第二天上午進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48h后收集細(xì)胞進(jìn)行功能檢測。對于原代細(xì)胞,可用促有絲分裂刺激物進(jìn)行細(xì)胞活化。2.對于貼壁細(xì)胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,用胰酶處理為單細(xì)胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。3.支原體污染會嚴(yán)重降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率,且支原體不會像細(xì)菌污染那么明顯,因而轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體。4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染時需要一定的細(xì)胞密度,以70-90%(貼壁細(xì)胞)或2×106-4×106細(xì)胞/ml(懸浮細(xì)胞)為宜。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟:1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6.到時后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。

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如何提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗效率:優(yōu)化細(xì)胞生長狀態(tài)密切觀察您的細(xì)胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前,先制定一個適當(dāng)?shù)姆N板方案,使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持較佳狀態(tài)。增加成功幾率—細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過程中的一個關(guān)鍵元素,它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的較重要的變量。此外,還常用促有絲分裂刺激物(如,細(xì)菌轉(zhuǎn)化,生長因子,條件培養(yǎng)基,以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞—在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異明顯。天生趨于懸浮的細(xì)胞(如HL60,Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染。相反,天生為貼壁的細(xì)胞(如HEK,CHO)則可適應(yīng)懸浮生長的條件。來指示細(xì)胞中目標(biāo)基因是否存在,這樣的報告基因一般可以在轉(zhuǎn)染后一兩天內(nèi)檢測到。石家莊正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)幾個名詞是從事生命科學(xué)研究的初學(xué)者經(jīng)常碰到的。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

細(xì)胞轉(zhuǎn)染,你至少要掌握以下幾點:主要有下面幾種方法::化學(xué)法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法;物理法:電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法;細(xì)菌介導(dǎo)法:逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A.陽離子脂質(zhì)體法:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點:簡單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機會遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B.電穿孔法:利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾,使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價