上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-07-18

免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)是一種用于研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。RIP技術(shù)可以幫助我們了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,并發(fā)現(xiàn)miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
RIP技術(shù)的原理是利用針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白的抗體,將細(xì)胞內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來(lái)。然后,可以通過(guò)分離純化,對(duì)這些復(fù)合物中的RNA進(jìn)行檢測(cè),如qPCR驗(yàn)證或測(cè)序分析。
表觀遺傳學(xué)和RNA生物學(xué)領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注增加。RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對(duì)RNA潛能的這一新認(rèn)識(shí)帶動(dòng)了新方法的發(fā)展,使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。
免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理,免疫沉淀

免疫沉淀IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
廣州anti Flag免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠免疫沉淀技術(shù)IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理,免疫沉淀

Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:
1. 樣品準(zhǔn)備:Co-IP實(shí)驗(yàn)通常有兩種,一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證,一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證。內(nèi)源性相互作用通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá);非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進(jìn)行預(yù)處理及細(xì)胞裂解獲得細(xì)胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白:利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體,抗體會(huì)與誘餌蛋白結(jié)合,利用磁鐵將磁珠拉下,同時(shí)誘餌蛋白會(huì)一起被沉淀出來(lái)。
3. SDS-PAGE及WB檢測(cè):得到沉淀后,需要驗(yàn)證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離,隨后利用WB檢測(cè)是否存在靶蛋白。
4. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置:為了避免“假陽(yáng)性”,需要設(shè)置正確的對(duì)照,包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(Input組)。Input組為直接利用抗體對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測(cè),驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實(shí)性:確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。

免疫沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過(guò)程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型:?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證:選擇已經(jīng)過(guò)免疫沉淀(Co-IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗(yàn)證的抗體,這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評(píng)價(jià),以幫助做出決策。
免疫沉淀技術(shù)RIP實(shí)驗(yàn)步驟。

上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理,免疫沉淀

RIP 技術(shù)的原理(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀)主要是運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái),經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測(cè)序分析。

RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用,但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物,RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同,如:RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶,抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等。
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。廣州anti Flag免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

免疫沉淀技術(shù)IP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么?上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)特性的重要方法。它具有一些明顯的優(yōu)點(diǎn),但也存在一些局限性。
優(yōu)點(diǎn):
1. 特異性強(qiáng):IP技術(shù)利用特異性抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行捕獲,因此具有很高的特異性。
2. 富集低豐度蛋白:可以從小量樣本中富集低豐度的目標(biāo)蛋白,有助于研究稀有蛋白。
3. 研究蛋白質(zhì)相互作用:通過(guò)Co-IP等變體技術(shù),可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。
4. 操作簡(jiǎn)便:IP實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單,容易在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。

缺點(diǎn):
1. 對(duì)抗體質(zhì)量依賴性高:需要高質(zhì)量的特異性抗體,否則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或?qū)嶒?yàn)失敗。
2. 存在非特異性結(jié)合:樣本中的其他蛋白質(zhì)可能非特異性地結(jié)合到抗體或固相載體上。
3. 可能破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象:裂解和洗滌步驟可能破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),影響其功能。
4. 可能存在背景噪聲:非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致背景噪聲,影響結(jié)果的清晰度和解釋。

上海Protein AG免疫沉淀磁珠原理

標(biāo)簽: 免疫沉淀 支原體