Real-time PCR的染料法和探針?lè)ǖ倪x擇:進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測(cè)定,采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的;染料法可以通過(guò)比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況;目的基因和內(nèi)參基因分管檢測(cè),染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX,探針?lè)ㄖ饕獞?yīng)用于病毒RNA的檢測(cè);以及單位點(diǎn)突變(SNP);多基因的合并檢測(cè),探針?lè)ㄟ€可用于同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的情況;而染料法則必須分管檢測(cè)。Real-time PCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡(jiǎn)稱Real-time PCR)是在定性PCR技術(shù)基...
Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR:1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2)競(jìng)爭(zhēng)法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計(jì)樣品中存在的給定序列的量。南京骨頭熒光PCR服務(wù)Real-tim...
Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中,加入過(guò)量SYBR螢光染料,SYBR螢光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射螢光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何螢光信號(hào),從而保證螢光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于:1、靈敏度高:使用SYBR可使螢光效果增強(qiáng)到1000倍以上。2、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。3、通用型方法,在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)。5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。Real-time PCR探針?lè)ㄆ毡橛糜谌祟悅魅静〉脑\斷和病原定量。廣州微量Real-time PCR服務(wù)聚合酶鏈...
Real-time PCR的染料法和探針?lè)ǖ倪x擇:進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測(cè)定,采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的;染料法可以通過(guò)比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況;目的基因和內(nèi)參基因分管檢測(cè),染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX,探針?lè)ㄖ饕獞?yīng)用于病毒RNA的檢測(cè);以及單位點(diǎn)突變(SNP);多基因的合并檢測(cè),探針?lè)ㄟ€可用于同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的情況;而染料法則必須分管檢測(cè)。Real-time PCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡(jiǎn)稱Real-time PCR)是在定性PCR技術(shù)基...
Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析:定量分析可以分為定量和相對(duì)定量?jī)煞N。定量指的是我們想知道某個(gè)基因在初始樣品中具體的拷貝數(shù)或濃度是多少?定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。而相對(duì)定量是指我們想知道某一個(gè)基因在不同樣品中表達(dá)量的差異,其目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例,而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。舉例來(lái)說(shuō),如研究項(xiàng)目中包括使用高鹽脅迫處理的樣本和未高鹽脅迫處理的樣本,記為已處理樣本和未處理樣本,通常可以將未處理樣本指定為基準(zhǔn),規(guī)定其目的基因濃度為100%,用已處理樣本的定量結(jié)果除以未處理樣本的定量結(jié)果,就可以計(jì)算每個(gè)已處...
Real-time PCR原理:Real-time PCR主要指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì),然后通過(guò)熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測(cè)每次PCR反應(yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,之后通過(guò)內(nèi)參法或外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列(目的基因)進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,這些熒光物質(zhì)可以在激發(fā)光的作用下釋放出一定波長(zhǎng)的發(fā)射光,定量用PCR儀通過(guò)對(duì)這些發(fā)射光進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),較終可以描繪出整個(gè)PCR的反應(yīng)過(guò)程,這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng):DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)...
引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng):1,引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子,不能在一個(gè)外顯子上(我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來(lái)擴(kuò)增的,如果有DNA污染的話,因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子,不可能完成擴(kuò)增。這對(duì)我們消除整個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用)。2,引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫度,方便于以后同時(shí)擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大,就得分開(kāi)做,浪費(fèi)模板,浪費(fèi)管家基因,所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要盡可能一致,這樣就不用每次查退火溫度,且對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)有利。許多疾病的未知病因的測(cè)序正在通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。南通組織熒光定量PCR研究方案Real-time PCR雙熒光標(biāo)記探針設(shè)計(jì)原則:具體的其他要求可以具體...
Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR:1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2)競(jìng)爭(zhēng)法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計(jì)樣品中存在的給定序列的量。無(wú)錫血液Real-time PCR設(shè)計(jì)...
Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題:靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性:出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶:PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)...
Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析:定性分析指的是用于分析待檢測(cè)的樣本中是否存在我們想要檢測(cè)的成分,即待檢測(cè)成分有無(wú)的分析。通常,定性分析可以應(yīng)用于病毒以及病原菌的檢測(cè),物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測(cè),如SARS、H1N1病毒,都可以通過(guò)Real-time PCR的方法進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè),定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國(guó)家的一些檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu),想要檢測(cè)進(jìn)口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分,或者用于檢測(cè)羊奶中是否會(huì)摻有牛奶等等,可以通過(guò)Real-time PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)?;蚍中?,如啤酒型,肥胖型基因的檢測(cè),就是Real-time...
Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng):每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不但操作煩瑣,而且價(jià)格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個(gè)循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于臨床。多重連接依賴探針擴(kuò)增允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo),從而避免多重PCR的分辨率限制。引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng):1,注意引物設(shè)計(jì)好后的產(chǎn)物長(zhǎng)度。Real-time PCR的較佳產(chǎn)物長(zhǎng)度在150-250kb左右(書(shū)上說(shuō)這樣可以增加熒光的敏感度,減少實(shí)驗(yàn)誤差,但是我對(duì)這個(gè)說(shuō)法持...
內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用,由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè),即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè),而PCR經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí),檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果有很大差異,因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響,若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo),則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng),尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí),這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為明顯。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的,所以...
Real-time PCR操作流程:1、收集樣品。2相關(guān)試劑總RNA提取試劑TREzolReagent(RNA提取試劑),M-MLV(cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶),RNA純化試劑,RealqPCRMasterMix(螢光定量PCR預(yù)混試劑)。3實(shí)驗(yàn)儀器螢光定量PCR儀;PCR儀;低溫離心機(jī)。4總RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl);Real-time PCR操作流程:2µl隨機(jī)引物(T18,10pmol/ul);2µl10mMdNTPmix;加水至15µl體系?;靹蚝?0℃變性RNA...
Real-time PCR原理:基于探針的化學(xué)法,Real-time PCR應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;依賴熒光能量共振傳遞(FRET)檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,單單檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,DNA及RNA定量;基因表達(dá)驗(yàn)證;等位基因鑒別;SNP分型;病原體和病毒檢測(cè);多重PCR,探針和目標(biāo)片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào),因此減少了背景熒光和假陽(yáng)性;探針可標(biāo)記不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán),用于多重PCR反應(yīng)。對(duì)于不同的靶序列需要合成不同的探針,原料成本較高。許多疾病的未知病因的測(cè)序正在通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。武漢細(xì)胞數(shù)字PCR服務(wù)所謂real-timeQ-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系...
Real-time PCR:Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量較準(zhǔn)確,重現(xiàn)性較好的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),普遍用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法,在Real-time PCR中,模板定量有兩種策略,相對(duì)定量和定量。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。臺(tái)州組織定量PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污...
Real-time PCR實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)-防止RNA酶污染的措施:1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。3.有機(jī)玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1%DEPC水沖洗,晾干。4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套...
Real-time PCR:使用Real-time PCR進(jìn)行基因檢測(cè),被普遍應(yīng)用于病毒和病原菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、遺傳病基因檢測(cè)等領(lǐng)域。一般首先需要利用專業(yè)使用的試劑盒從待檢樣品中提取其核酸(DNAorRNA),并經(jīng)過(guò)精制等復(fù)雜的操作(通常稱為前處理操作)之后才可以進(jìn)行Real-time PCR。不易受反應(yīng)阻害物的影響,使用時(shí)不需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理操作,單單需將待檢樣品直接加入到檢測(cè)試劑中即可開(kāi)始檢測(cè)。通過(guò)使用本產(chǎn)品,可以在更短的時(shí)間內(nèi),簡(jiǎn)便、低成本地進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR通用電腦,自動(dòng)分析軟件等構(gòu)成。寧波組織定量PCR原理Real-time PCR從用途上分可...
Real-time PCR原理:Real-time PCR主要指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì),然后通過(guò)熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測(cè)每次PCR反應(yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,之后通過(guò)內(nèi)參法或外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列(目的基因)進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,這些熒光物質(zhì)可以在激發(fā)光的作用下釋放出一定波長(zhǎng)的發(fā)射光,定量用PCR儀通過(guò)對(duì)這些發(fā)射光進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),較終可以描繪出整個(gè)PCR的反應(yīng)過(guò)程,這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng):DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)...
所謂real-timeQ-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,之后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中,兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn),它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。基于探針的化學(xué)法,Real-time PCR應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探...
Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn):靈敏度高:PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞;在病毒的檢測(cè)中,PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速:PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無(wú)放射性污染、易推廣。純度要求低:不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。...
Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR:擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,之后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。聚合酶鏈反應(yīng)五要素:參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即:引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。麗水特殊樣本定量PCRReal-time P...
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過(guò)這項(xiàng)技術(shù),可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因,而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡(jiǎn)單,廉價(jià)和可靠的方法復(fù)制DN段,這個(gè)概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究,犯罪取證和分子考古學(xué)。通常,PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成,稱為熱循環(huán),每個(gè)循環(huán)通常由兩個(gè)或三個(gè)離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。溫州血液RT-PCR檢測(cè)技...
引物的設(shè)計(jì)對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,因?yàn)镽eal-time PCR的檢測(cè)靈敏度比較高,所以相應(yīng)的對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道,還有幾點(diǎn)必須注意:1,引物的錯(cuò)配率(引物錯(cuò)配形成引物二聚體,但是SYBR照樣能嵌入進(jìn)去,結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差很大,重復(fù)性也不好)。2,引物的特異性一定要高(不像常規(guī)PCR,引物同源性不高,只要兩條產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度相差足夠大,在電泳的時(shí)候能夠區(qū)分開(kāi)就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時(shí)候能分開(kāi),所以這就造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大,不可信)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限。南京微量數(shù)字PCR原理Real-time P...
Real-time PCR實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)-防止RNA酶污染的措施:1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。3.有機(jī)玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1%DEPC水沖洗,晾干。4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套...
Real-timePCR技術(shù)服務(wù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染:實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè):一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。重復(fù)性試驗(yàn)。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-time PCR反是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理。上海實(shí)時(shí)熒光定量PCRReal-time PCR原理:所謂實(shí)...
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)。常州特殊樣本定量PCR哪家好Real-time PCR與普通PCR的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?,?..
Real-time PCR雙熒光標(biāo)記探針設(shè)計(jì)原則:具體的其他要求可以具體聯(lián)系設(shè)計(jì)公司,拿到合成好的引物,需要先確認(rèn)引物的性能??梢杂眠@對(duì)引物先擴(kuò)增梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品介紹見(jiàn)后續(xù)內(nèi)容)。由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品的加量和其對(duì)應(yīng)的Ct值,描繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這里要注意根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的參數(shù)是非常重要的。引物性能確認(rèn):1.決定系數(shù)R2大于0.98,越接近于1,結(jié)果越可靠。2.擴(kuò)增效率一般要求在0.8-1.2,越接近于1,越好。3.檢測(cè)的靈敏度,必須確認(rèn),通常要求35個(gè)循環(huán)以內(nèi),一般可以得到比較好的定量結(jié)果,30個(gè)循環(huán)以內(nèi),沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。4.NTC是必須要確認(rèn)的,通常要求30個(gè)循環(huán)內(nèi)沒(méi)有引物二聚體...
引物的設(shè)計(jì)對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,因?yàn)镽eal-time PCR的檢測(cè)靈敏度比較高,所以相應(yīng)的對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道,還有幾點(diǎn)必須注意:1,引物的錯(cuò)配率(引物錯(cuò)配形成引物二聚體,但是SYBR照樣能嵌入進(jìn)去,結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差很大,重復(fù)性也不好)。2,引物的特異性一定要高(不像常規(guī)PCR,引物同源性不高,只要兩條產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度相差足夠大,在電泳的時(shí)候能夠區(qū)分開(kāi)就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時(shí)候能分開(kāi),所以這就造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大,不可信)。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計(jì)樣品中存在的給定序列的量。蘇州血液RT-PCR檢測(cè)...
Real-time PCR鏈反應(yīng)注意事項(xiàng):在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中,注意避免mRNA的斷裂;為了防止非特異性擴(kuò)增,必須設(shè)陰性對(duì)照;內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期,出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定;防止DNA的污染:采用D...
所謂real-timeQ-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,之后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中,兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn),它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)。南通骨頭PCR...