免疫熒光實驗的注意事項:為了保證熒光染色的正確性,初次試驗時需設(shè)置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對照(抑制試驗):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照:已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光,則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,也可以用于檢測和定位抗體。CTNT免疫熒光IF
免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)collagenX(COL-10)免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡、細胞增殖和細胞分化等生物學(xué)過程。
細胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進行細胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。
免疫熒光通透(目的是使抗體進入胞內(nèi)),0.5%TritonX-100(一種去垢劑,用PBS配制)室溫通透20min(針對胞內(nèi)抗原,若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟);除了TritonX-100,也可作為通透劑,并且固定后的樣品不需要通透。封閉(減少一抗和二抗與非特異位點進行結(jié)合),通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室溫封閉30min。常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,可以實現(xiàn)精確的免疫檢測。
直接免疫熒光:單抗體(一抗)用于免疫染色和檢測目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合,并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點:由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性,從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比,時間縮短(操作步驟減少)。直接免疫熒光的缺點:不允許通過二抗進行信號放大;檢測靈敏度降低;熒光素結(jié)合一抗的選擇有限;與使用熒光二抗的檢測相比,更昂貴。間接免疫熒光:使用兩種抗體(一抗和二抗)進行免疫染色并檢測目標(biāo)蛋白。首先,用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后,熒光素結(jié)合的二抗(與一抗具有不同的物種反應(yīng)性)識別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個以上的二抗可以與一抗結(jié)合,熒光信號被放大,提供了更高的檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。CD20免疫抗體
免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,可以用于檢測病原體、肉瘤標(biāo)志物等。CTNT免疫熒光IF
熒光色素:異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長為490495nm,較大發(fā)射光波長520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是:①人眼對黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長為570nm,較大發(fā)射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。CTNT免疫熒光IF