細(xì)胞和組織樣品處理:準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品:為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定,然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,標(biāo)記目的靶點(diǎn)。封閉細(xì)胞樣品,防止熒光標(biāo)記物與研究無(wú)關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)中,以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。ZO-1免疫熒光試驗(yàn)
免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,利用定量技術(shù)測(cè)定含量,從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。細(xì)胞免疫熒光用途:快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位。材料與儀器:樣品:貼壁細(xì)胞;試劑:4% 組織固定液,PBS,Triton X-100,BSA,熒光二抗,免疫熒光染色二抗稀釋液,抗熒光猝滅封片液,0.25% 胰酶;器材:6/12/24 孔板,細(xì)胞爬片(蓋玻片),載玻片,15 ml 離心管。P21免疫組化免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子,通過(guò)不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1:20,抗體濃度過(guò)低,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱,影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時(shí)間可以從10min到數(shù)小時(shí),一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強(qiáng)染色效果,但對(duì)不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較37℃30min效果好的多。
細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致:1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,PBS洗三遍。注意:有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,因此夾取的時(shí)候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比較方便,避免了來(lái)回夾取,另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,也可37度2小時(shí),感覺前者效果好,PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光),或者37度1半小時(shí),PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光技術(shù)可以用于研究?jī)?nèi)臟移植和免疫抑制。
熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn):由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加;與直接免疫熒光相比,時(shí)間更長(zhǎng)(操作步驟更多)。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大;與直接免疫熒光相比,通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度;熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn):由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題增加;與直接免疫熒光相比,時(shí)間更長(zhǎng)(操作步驟更多)。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。ZO-1免疫熒光試驗(yàn)
免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。ZO-1免疫熒光試驗(yàn)
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng),即可結(jié)合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應(yīng)結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應(yīng),形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。ZO-1免疫熒光試驗(yàn)