cyclinD1免疫組化

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-03-20

熒光色素:異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是:①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595~600nm,呈橘紅色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。cyclinD1免疫組化

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其他熒光物質(zhì):1.酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。2.鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。所需要的儀器:熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡。collagen3免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。

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免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散),固定液包括:有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過(guò),目前甲醛用的還是較多的,但針對(duì)磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇,同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間:取決于組合塊的大小和類型,對(duì)于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細(xì)胞固定時(shí)間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1、建議細(xì)胞直接種孔板,采用倒置熒光顯微鏡拍照,這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果;2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購(gòu)買處理過(guò)的細(xì)胞爬片;若只有普通細(xì)胞爬片,可以先將爬片于濃酸(濃酸腐蝕性強(qiáng),注意操作)或 75% 乙醇浸泡過(guò)夜,若用酸浸泡過(guò)夜,第二天先用自來(lái)水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,若用 75% 乙醇浸泡,則不需要此步驟。然后,用洗潔精搓洗爬片,然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干,再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達(dá)水平。

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免疫熒光注意事項(xiàng):對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置:1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照:某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),會(huì)產(chǎn)生背景熒光,對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察,確保抗原本身沒(méi)有信號(hào)。2、陽(yáng)性對(duì)照:用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性,可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對(duì)照:與陽(yáng)性對(duì)照相反,用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色,結(jié)果若為陰性,可排除染色過(guò)程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果。在實(shí)際工作中,熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少,因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù)。collagen3免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。cyclinD1免疫組化

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟:細(xì)胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過(guò)夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。cyclinD1免疫組化