免疫熒光實驗步驟:1.樣本準(zhǔn)備:細胞或薄組織。對單層生長細胞,在傳代培養(yǎng)時,將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞,取對數(shù)生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定:取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。PDL-1/CD274免疫熒光檢查
熒光效率:熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強度)。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度,除受激發(fā)光強度影響外,也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜),即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,得到的熒光強度也較大。MBP免疫抗體免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。
細胞免疫熒光:細胞種板與細胞爬片制備:1) 細胞密度在90%-95%左右,用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,充分吹打,使之成單細胞懸液,計數(shù)。2)取細胞培養(yǎng)12孔板,在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,然后將爬片置于液滴上,壓緊,使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,防止加細胞懸液時爬片漂起,造成雙層細胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后,根據(jù)細胞生長速度快慢,觀察判斷細胞密度,約90%時進行細胞免疫熒光。
注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm,發(fā)藍光;FITC激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555nm,發(fā)綠光;CY3激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm,發(fā)紅光)。兩種抗體同時孵育:由于FIT容易萃滅,因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標(biāo)記免疫技術(shù)。
免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項:1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長,會使熒光減弱。2)每次試驗時,需設(shè)置以下三種對照:①陽性對照:陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照:陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照:PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。MBP免疫抗體
免疫熒光技術(shù)中,以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。PDL-1/CD274免疫熒光檢查
熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點:由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問題增加;與直接免疫熒光相比,時間更長(操作步驟更多)。間接免疫熒光的優(yōu)點:通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大;與直接免疫熒光相比,通過信號放大提高檢測靈敏度;熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍;與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比,成本較低。間接免疫熒光的缺點:由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,因此物種交叉反應(yīng)性問題增加;與直接免疫熒光相比,時間更長(操作步驟更多)。PDL-1/CD274免疫熒光檢查