bcl-2免疫熒光IF

來源: 發(fā)布時間:2024-03-09

其他熒光物質(zhì):酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光,激發(fā)光波長為360nm,發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,發(fā)射光波長范圍窄,熒光衰變時間長,較適合用于分辨熒光免疫測定。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。bcl-2免疫熒光IF

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細胞免疫熒光實驗注意事項:非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復(fù)過度。染色過深:一抗?jié)舛冗^高;染色試濃度過高或孵育時間過長;染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設(shè)陰性對照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時,保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。AIRE-1免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。

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免疫熒光注意事項:對照實驗的設(shè)置:1、內(nèi)源性組織背景對照:某些細胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),會產(chǎn)生背景熒光,對結(jié)果產(chǎn)生影響,例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,應(yīng)對樣品進行觀察,確保抗原本身沒有信號。2、陽性對照:用確認含有待測抗原的組織或細胞,與待測標本進行統(tǒng)一處理,結(jié)果應(yīng)為陽性,可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照:與陽性對照相反,用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色,結(jié)果若為陰性,可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。

免疫熒光的原理和類型:免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長(分子的吸收光譜)下吸收光子的特性,經(jīng)過短暫的間隔(發(fā)射光譜)后以較高的波長發(fā)射光子,并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞,可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時,首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時,熒光團與目標抗原的抗體結(jié)合,然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點和作用機制。

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細胞免疫熒光:細胞種板與細胞爬片制備:1) 細胞密度在90%-95%左右,用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,充分吹打,使之成單細胞懸液,計數(shù)。2)取細胞培養(yǎng)12孔板,在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,然后將爬片置于液滴上,壓緊,使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,防止加細胞懸液時爬片漂起,造成雙層細胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后,根據(jù)細胞生長速度快慢,觀察判斷細胞密度,約90%時進行細胞免疫熒光。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,幫助揭示細胞和分子的功能和相互關(guān)系。bcl-2免疫熒光IF

免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,可以用于檢測病原體、肉瘤標志物等。bcl-2免疫熒光IF

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號:細胞或組織樣本保存時間過長;2)抗體濃度不合適,參照抗體說明書的稀釋濃度,再根據(jù)樣本表達量進行摸索;3)一抗孵育時間不合適,建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過高;抗體孵育時間過長或溫度過高;清洗不充分;樣本變干,染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染**cl-2免疫熒光IF