CD31免疫組化IHC

細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，細胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標記，標記完成后，顯微鏡下觀察細胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細胞內(nèi)信號傳導提供一個明確的指導，細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點，是目前比較常用的組織學技術(shù)，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。CD31免疫組化IHC

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應(yīng)用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。CD31免疫組化IHC免疫熒光在醫(yī)學診斷中起著重要作用，可以用于檢測病原體、肉瘤標志物等。

熒光的產(chǎn)生：一此化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應(yīng)所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標記。

細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡、細胞增殖和細胞分化等生物學過程。

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)分子的相互作用。CD31免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)在免疫學研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關(guān)系。CD31免疫組化IHC

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應(yīng)輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。CD31免疫組化IHC