CRT(Calreticulin)免疫熒光

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會逐漸下降。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。CRT(Calreticulin)免疫熒光

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)CRT(Calreticulin)免疫熒光熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比，時(shí)間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過二抗進(jìn)行信號放大；檢測靈敏度降低；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測目標(biāo)蛋白。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合，熒光信號被放大，提供了更高的檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測。CRT(Calreticulin)免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。CRT(Calreticulin)免疫熒光

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡。CRT(Calreticulin)免疫熒光

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