海洋生物外泌體蛋白質(zhì)組學

磁珠免疫法分離外泌體：將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面，然后將磁珠與樣品共孵育，使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗，結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對于ELISA的好處主要是，珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體，從而提高了分離效率。此外，使用磁珠時，樣品起始體積沒有上限，而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL，且ELISA洗脫雜質(zhì)時容易造成孔間交叉污染。當將磁珠法與金標準外泌體分離方法進行比較時，磁珠法可分離出更純凈的外泌體，特異性高、速度更快，并且不需要昂貴的儀器。另外，與其他分離方法相比，磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。外泌體的膜同細胞一樣，是磷脂雙分子層。海洋生物外泌體蛋白質(zhì)組學

PEG沉淀法分離外泌體：通常通過將無水聚合物，如聚乙二醇（PEG），與樣品混合來沉淀外泌體。PEG聚合物競爭性結(jié)合水分子，增加疏水性蛋白和脂質(zhì)分子的相互結(jié)合力從而沉淀外泌體，然后通過離心分離外泌體。這種分離的方法快速，簡便，可用于各種起始體積（從100μL到幾毫升）適合于各種研究和臨床設定。然而，這種方法缺乏選擇性，PEG聚合物不只會導致外泌體小泡沉淀，還會引起其他細胞外囊泡、細胞外蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體沉淀。因此，在使用這種方法之前，必須進行樣品預處理，例如過濾或超速離心，以減少較終的外泌體制劑的污染。牛奶提取試劑盒服務外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡。

外泌體生物學功能：1、在心血管系統(tǒng)中，據(jù)報道，源自人胚胎干細胞（ESC）的間充質(zhì)干細胞（MSC）外泌體可減少小鼠和豬模型中的心肌缺血和再灌注損傷；2、在免疫系統(tǒng)中，據(jù)報道趨化因子受體CCR5通過外泌體在細胞之間轉(zhuǎn)移是細胞人類免疫缺陷病毒傳染的一種機制；3、在中樞的神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，外泌體的作用是消除廢物并介導大腦活動，從而阻止神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機理；迄今為止，尚未完全發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)外泌體-細胞結(jié)合的途徑。然而，比較明顯，其結(jié)合過程從外泌體識別受體細胞PM上的特定受體開始。膜受體的識別是外泌體細胞反應的基礎，它可能活躍受體并隨后導致相關(guān)信號通路的活躍，外泌體與PM融合或外泌體的內(nèi)吞作用，從而導致蛋白質(zhì)和RNA直接釋放到受體細胞中。從研究上來講并不太嚴格區(qū)分外泌體或微泡。

外泌體與免疫反應、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞的神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和病癥進展相關(guān)。由外泌體傳遞到受體細胞的蛋白質(zhì)、代謝物和核酸有效地改變了它們的生物反應。這種外泌體介導的反應可以促進或阻止疾病。外泌體在調(diào)節(jié)復雜的細胞內(nèi)通路方面的固有特性使其在許多疾病的診療控制方面具有潛在的用途，包括神經(jīng)退行性疾病和病癥。外泌體可被設計用于遞送不同的診療有效載荷，包括短干擾rna、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑，并具有將其遞送到預期目標的能力。外泌體實際應用之前，需要使用大型動物模型進行進一步研究和臨床試驗。

外泌體的提取分離方法：1、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑；此外，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。2、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。外泌體由各種類型的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生自形成外泌體的親代細胞。福建腦脊液外泌體

隨著外泌體研究的不斷深入，它的應用已經(jīng)涉及醫(yī)學基礎和免疫領域、寄生蟲領域。海洋生物外泌體蛋白質(zhì)組學

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：將其中一種針對外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上，將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中，由于抗體-抗原相互作用，表達抗原的外泌體將被捕獲固定在板上。將未捕獲的樣品內(nèi)容物洗掉，并使用另一種抗體檢測固定的外泌體。ELISA已用于從尿液、血漿和血清中分離出外泌體，當使用標準液（已知外泌體的量）創(chuàng)建標準曲線時，甚至可以進行定量。但是，此方法需要通過超速離心或超濾對樣品進行預處理。同樣，流場-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測器相結(jié)合已被用于分析外泌體的大小和純度。外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡。海洋生物外泌體蛋白質(zhì)組學

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