細胞上清外泌體iTRAQ

外泌體是分泌的細胞外囊泡的主要群體，是具有生物活性的脂雙層囊泡，大小約為30-100nm，由不同類型的正常細胞和瘤子細胞自然產生和釋放。這些囊泡在細胞間通訊中起重要作用，并影響細胞外環(huán)境和免疫系統(tǒng)反應。外泌體通過內體途徑分泌到細胞外空間，并將各種生物活性分子（貨物）轉運至靶細胞。外泌體貨物的組成非常多樣化，包括各種免疫阻止和免疫刺激蛋白、趨化因子、細胞因子、細胞受體、脂質以及不同的核酸，如miRNA和環(huán)狀RNA。外泌體可以通過多種方法給藥，靜脈內給藥是較常用的途徑。外泌體其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。細胞上清外泌體iTRAQ

磁珠免疫法分離外泌體：將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面，然后將磁珠與樣品共孵育，使外泌體特異性結合到磁珠上形成磁珠-外泌體復合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗，結尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對于ELISA的好處主要是，珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體，從而提高了分離效率。此外，使用磁珠時，樣品起始體積沒有上限，而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL，且ELISA洗脫雜質時容易造成孔間交叉污染。當將磁珠法與金標準外泌體分離方法進行比較時，磁珠法可分離出更純凈的外泌體，特異性高、速度更快，并且不需要昂貴的儀器。另外，與其他分離方法相比，磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。外泌體pd-l1對pd-l1抗體耐受對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。

肉瘤細胞可以通過產生異常的抗肉瘤或肉瘤免疫應答并促進瘤子細胞的活動而大量產生外泌體，這些外泌體富含促病的細胞成分，例如PD-L1、mRNA和micro-RNA等免疫阻止蛋白，參與病癥的發(fā)展、轉移和耐藥性。值得注意的是，肉瘤分泌的外泌體表面和外泌體顆粒中均存在的PD-L1。ESCRT（運輸所需的內體分選復合體）參與將生物分子包裝到外泌體中，nSMase2（中性鞘磷脂酶2）和Rab蛋白調節(jié)外泌體分泌。已確定ESCRT、Rab27a和nSMase2參與外泌體PD-L1的包裝和分泌。外泌體可以將PD-L1轉運至其他PD-L1表達低或沒有PD-L1的細胞，并可能與PD-1結合。

外泌體中常見的細胞質蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調節(jié)外泌體膜與受體細胞的融合，有文獻報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內體?，F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族（CD63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結腸上皮細胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。外泌體發(fā)揮功能：將細胞或組織中多余的或者有害的分子排除，這為研究生物標志物提供了可能。外泌體膜可以與靶細胞膜直接融合，非選擇性的釋放其所含的蛋白質、mRNA以及microRNA。

外泌體中常見的細胞質蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調節(jié)外泌體膜與受體細胞的融合，有文獻報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內體?，F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族（CD63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結腸上皮細胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡(30–150nm)，由所有體外和體內細胞持續(xù)分泌。細菌外泌體提取試劑盒生產廠家

NTA技術已被作為外泌體表征手段之一。細胞上清外泌體iTRAQ

NTA技術已被作為外泌體表征手段之一，相較于其他表征方式NTA技術的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度更快。大致方法是：將分離的外泌體樣本注入納米顆粒追蹤分析儀，用激光光束穿過樣本，激光在腔室內與顆粒相互作用時會發(fā)生散射，通過裝有攝像頭的顯微鏡收集散射光，捕捉外泌體的布朗運動，實現(xiàn)顆?？梢暬Ｈ缓笫褂肧tokes-Einstein方程來測量粒子的平均速度，繼而估算粒子的大小。NTA能夠測量粒徑10-1000nm之間的顆粒，包含了外泌體50-150nm的徑粒范圍，但是NTA鑒定需要大于0.5毫升的樣品體積以及優(yōu)化的數據收集和分析參數，另外，NTA比較難區(qū)分與外泌體具有相似布朗運動的蛋白質聚集體，因此無法排除其他物質干擾。細胞上清外泌體iTRAQ

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