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PCR方法主要可以分為三類：終點(diǎn)PCR、qPCR和dPCR。終點(diǎn)PCR終點(diǎn)PCR是較原始、較簡單的PCR方法，如今仍在被我們普遍使用。使用者只能在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等方法對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。終點(diǎn)PCR本身是無法定量的，因?yàn)樵摲磻?yīng)產(chǎn)出的DNA量不一定能反映較初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴(kuò)增效率是有差異的。qPCR和dPCR研究者們通過兩種途徑克服了PCR定量分析的挑戰(zhàn)：實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（dPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監(jiān)控PCR過程中的熒光強(qiáng)度比較多個(gè)樣品的DNA水平。數(shù)字PCR（dPCR）的基本工作原理很簡單，先將樣品劃分為多個(gè)PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)較多只含有一個(gè)模板。然后通過計(jì)數(shù)正負(fù)反應(yīng)來確定初始樣品中模板分子的數(shù)量。pcr內(nèi)標(biāo)不出來的原因是什么？貴州常見pcr外包

PCR反應(yīng)的比較大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭疼的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。主要原因有：1、標(biāo)本間交叉污染；2、PCR試劑的污染；3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染；4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。2、陰性對照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括：（1）標(biāo)本對照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。（2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試劑是否污染。3、重復(fù)性試驗(yàn)。4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。江西推薦pcr多少錢細(xì)胞上清提取RNA進(jìn)行PCR檢測。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點(diǎn)介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時(shí)RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個(gè)基因的RT-PCR。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的多重PCR（MultiplexPCR））介紹：多重PCR可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的片段。多重PCR不僅意味著節(jié)約時(shí)間、試劑和樣本，同時(shí)使得多個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行同時(shí)比較成為可能。當(dāng)一個(gè)反應(yīng)管中存在多個(gè)引物對時(shí)，如在多重PCR中，非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率的降低是較關(guān)注的問題，因?yàn)榉磻?yīng)的優(yōu)化不可能針對所有的引物對和片段。因此，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，以減少錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增。引物序列對于目標(biāo)片段應(yīng)該是獨(dú)特的，且所有引物的Tm值差異應(yīng)在5℃內(nèi)。在進(jìn)行多重PCR前，每個(gè)引物對應(yīng)在單個(gè)反應(yīng)中驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率。而且，不同大小的擴(kuò)增子應(yīng)在凝膠電泳中可區(qū)分開，以便鑒定。除了引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增子大小，熱啟動(dòng)DNA聚合酶和特殊優(yōu)化的PCR緩沖液對于多重PCR也是必需的，它們可有助于擴(kuò)增的成功率和擴(kuò)增的特異性。做pcr檢測，每個(gè)樣本多少錢？

PCR引物設(shè)計(jì)的原則PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。（1）引物設(shè)計(jì)的基本原則引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC比較好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是較末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，比較好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。英瀚斯生物，可承接各類熒光定量pcr檢測。云南樣本pcr擴(kuò)增

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PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DNA的片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設(shè)計(jì)方法，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同。PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個(gè)原則，1號純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分較為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。貴州常見pcr外包

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