PCR在**和遺傳病方面也有一定的應(yīng)用。*基因的表達(dá)增加和突變,在許多**早期和良性的階段就可出現(xiàn)。PCR技術(shù)不但能有效的檢測基因的突變,而且能準(zhǔn)確檢測*基因的表達(dá)量,可據(jù)此進(jìn)行早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測到原*基因易位導(dǎo)致的BCR/ABL融合基因形成,定量PCR技術(shù)可通過檢測BCR/ABL融合基因的表達(dá)確定微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量,以此作為***效果和估計(jì)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性的依據(jù)。一些病毒致*作用也與病毒載量有關(guān),EB病毒載量的FQ-PCR檢測結(jié)果已被用于鼻咽*早期發(fā)現(xiàn)和隨訪。PCR技術(shù)初次臨床應(yīng)用就是從檢測鐮狀細(xì)胞和β-地中海貧血的基因突變開始的?;虻耐蛔兒腿笔Ь鶗鸶鞣N珠蛋白的表達(dá)不平衡,用FQ-PCR檢測各種珠蛋白基因表達(dá)差異,是地中海貧血診斷的有效手段。英瀚斯生物pcr檢測,保證真實(shí)實(shí)驗(yàn)檢測,數(shù)據(jù)保密完整性。內(nèi)蒙古常見pcr多少錢
原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng),它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR是Hasse等于1990年建立的,實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為:1、固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上,并用多聚甲醛處理,再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶。2、蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55℃消化處理2h后,96℃2min以滅活蛋白酶K。3、PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上,加PCR反應(yīng)液,覆蓋并加液體石蠟后,直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上,進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置。4、雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后,用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交。5、顯微鏡觀察結(jié)果。安徽推薦pcr擴(kuò)增一步法熒光定量pcr在哪做?
PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的MSP甲基化特異PCR介紹:一般調(diào)控區(qū)保持甲基化狀態(tài),基因不表達(dá)直接干擾轉(zhuǎn)錄因子和啟動子識別位點(diǎn)的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合引起基因沉默改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)MSP甲基化特異PCR是用對苯二酚和亞硫酸氫鈉處理氫氧化鈉變性的基因組DNA,使得未甲基化的C轉(zhuǎn)化為T.按照C轉(zhuǎn)換T后的基因序列設(shè)計(jì)出來的引物擴(kuò)出目的基因。由于甲基化CpG島中的C不能被轉(zhuǎn)化為T,用以上的引物將不會擴(kuò)出目的基因。通過上述手段就能達(dá)到識別基因組DNA甲基化與否的目的。
PCR的假陽性主要原因之一出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶:PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。PCR的假陽性主要原因之一出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶:PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。熒光定量pcr的ct值怎么分析?
PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的多重PCR(MultiplexPCR))介紹:多重PCR可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的片段。多重PCR不僅意味著節(jié)約時(shí)間、試劑和樣本,同時(shí)使得多個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行同時(shí)比較成為可能。當(dāng)一個(gè)反應(yīng)管中存在多個(gè)引物對時(shí),如在多重PCR中,非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率的降低是較關(guān)注的問題,因?yàn)榉磻?yīng)的優(yōu)化不可能針對所有的引物對和片段。因此,引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要,以減少錯配引起的非特異性擴(kuò)增。引物序列對于目標(biāo)片段應(yīng)該是獨(dú)特的,且所有引物的Tm值差異應(yīng)在5℃內(nèi)。在進(jìn)行多重PCR前,每個(gè)引物對應(yīng)在單個(gè)反應(yīng)中驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率。而且,不同大小的擴(kuò)增子應(yīng)在凝膠電泳中可區(qū)分開,以便鑒定。除了引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增子大小,熱啟動DNA聚合酶和特殊優(yōu)化的PCR緩沖液對于多重PCR也是必需的,它們可有助于擴(kuò)增的成功率和擴(kuò)增的特異性。做一次pcr檢測要多久?細(xì)胞pcr是什么意思
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PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的巢氏PCR(NestedPCR)介紹:巢氏PCR需要兩到三對引物,一般采用較為套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán),再用擴(kuò)增DNA的片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán),這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增,而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火,從而增加了特異性擴(kuò)增,提高了擴(kuò)增效率。若將套失PCR的內(nèi)外引物稍加改變,延長外引物長度(25-30bp),同時(shí)縮短內(nèi)引物長度(15-17bp),使外引物先在高退火溫度下復(fù)性,做雙溫?cái)U(kuò)增,然后改換至三溫循環(huán),使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上,在低退火溫度復(fù)性,直到擴(kuò)增完成,這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)加入。內(nèi)蒙古常見pcr多少錢
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